Papel do NLRP3 na disfunção erétil em modelo de hipertensão DOCA/sal e sua possível ativação por ET-1

Autor(es)

Rafael Sobrano Fais

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2020-03-03

Membros da banca

Fernando Silva Carneiro; Edson Antunes; Riccardo Lacchini; Luciana Venturini Rossoni

• Orientador: Fernando Silva Carneiro

Resumo

Introdução: A disfunção erétil (DE) é definida como a incapacidade de alcançar ou manter a ereção do pênis para um desempenho sexual satisfatório. A DE está, frequentemente, associada a fatores de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares como hipertensão arterial, e/ou doenças metabólicas como dislipidemia e diabetes. A hipertensão arterial tem se tornado um problema crescente de saúde pública, pois é importante fator de risco para o aparecimento de doenças cardiovasculares, cerebrovasculares e renais. Além disso, a DE ocorre com o dobro da frequência em pacientes com hipertensão arterial em relação a pacientes normotensos. Os danos vasculares na hipertensão arterial ocorrem, em parte, devido ao aumento de mediadores inflamatórios. Similarmente, diversos estudos mostram que o aumento da expressão de mediadores inflamatórios está intimamente ligado ao desenvolvimento de DE. A DE é fortemente influenciada pelo aumento da expressão de endotelina-1 (ET-1) em modelo de hipertensão DOCA/sal, devido a seus efeitos contráteis e pró-inflamatórios. O receptor NLRP3 é o membro mais estudado da família do inflamassoma, um complexo multiprotéico do sistema imune inato que desencadeia ativação de caspase-1 e maturação de citocinas pró-inflamatórias, tais como a interleucina-1 beta (IL-1β). O aumento da atividade do receptor NLRP3 promove alterações vasculares, hipertrofia cardíaca e renal, além de aumento na pressão arterial. No entanto, ainda é desconhecido se o NLRP3 contribui para a ação pró-inflamatória da ET-1. Hipótese: O NLRP3 medeia efeitos pró-inflamatórios crônicos da ET-1 no CC de animais DOCA/sal, constituindo-se mecanismo importante para a gênese da DE. Objetivo: Investigar o papel do NLRP3 na liberação de citocinas pró-inflamatórias e recrutamento de células do sistema imune, induzido pela ET-1 e na DE associada ao modelo de hipertensão DOCA/sal. Métodos: Camundongos C57BL/6 (WT) e deficientes para NLRP3 (NLRP3-/-) foram uninefrectomizados e receberam um pellet de silicone contendo desoxicorticosterona acetato (DOCA, 2,4mg/Kg/dia) ou vazio por 21 dias. Estes animais WT foram tratados com bosentan (gavagem 30 mg/Kg/dia) nos últimos 10 dias. Foi verificada a pressão arterial sistólica por pletismografia de cauda destes camundongos antes e nos dias 3, 7, 10, 14 e 21 após a cirurgia. Os níveis de ET-1 foram avaliados no soro, ao passo que os de IL- 1β, TNF-α e IL-6 foram dosados no corpo cavernoso (CC). Avaliamos também a atividade da caspase-1 por meio da sonda fluorescente FLICA. A expressão da caspase-1, pró-caspase-1, IL-1β e pró-IL-1β foi avaliada por Western blotting. A função erétil foi determinada ao estimular eletricamente o nervo cavernoso nas frequências de 0,2 a 20 Hz. A razão entre a média do platô da pressão intracavernosa e a pressão arterial média (PIC/PAM) foi obtida e analisada. A PIC/PAM também foi realizada em resposta a injeção de ET-1 (0,2492 µg/Kg) no CC de camundongos WT com administração prévia de MCC950 (0,42646 µg/Kg) ou veículo no CC. A reatividade do CC foi avaliada pelo relaxamento mediado por estímulo elétrico, para10 acetilcolina e nitroprussiato de sódio, ao passo que a contração foi induzida por fenilefrina. Avaliamos, por citometria de fluxo, o infiltrado de células do sistema imune no CC (macrófagos, neutrófilos, linfócitos Th1 e Th17). A expressão de ICAM-1, VCAM-1, de CCL2 alpha-actina do músculo liso e deposição de colágeno foi determinada. Por último, camundongos WT ou deficientes para RAG-1 (RAG-1-/-) foram uninefrectomizados e receberam um pellet de silicone contendo DOCA (2,4mg/Kg/dia) ou vazio por 21 dias. Afim de verificar o efeito da depleção de neutrófilos na função erétil, camundongos WT foram tratados com anticorpo para depleção de neutrófilos (BE0075-1, injeção intraperitoneal 200 µg) ou veículo nos dias 12 e 17 após a cirurgia. Foi medida a pressão arterial sistólica por pletismografia de cauda destes animais antes, e nos dias 3, 7, 10, 14 e 21 após a cirurgia. A PIC/PAM também foi registrada nesse grupo de animais. Resultados: Os camundongos submetidos ao modelo de hipertensão DOCA/sal tiveram aumento dos níveis de TNF-α, atividade da caspase-1, expressão da caspase-1 e IL-β no CC. O tratamento com bosentan ou a ausência do NLRP3 reverteu ou preveniu estas alterações. Além disso, o tratamento com bosentan, a inibição farmacológica do NLRP3 ou a ausência do NLRP3 restaurou a função erétil (PIC/PAM) e o relaxamento para acetilcolina e para nitroprussitato de sódio no CC de camundongos DOCA/sal. Houve aumento no recrutamento de neutrófilos e linfócitos Th1 para o CC de camundongos DOCA/sal. No entanto, o tratamento com bosentan ou a ausência do NLRP3 preveniu esse aumento. Ainda, o aumento de VCAM-1, ICAM-1 e CCL2 promovido pela hipertensão DOCA/sal foi prevenido pelo tratamento com bosentan ou a deleção gênica do NLRP3. Adicionalmente, observamos que o tratamento com bosentan ou a ausência do NLRP3 previne o aumento na deposição de colágeno ou a de músculo liso no CC dos camundongos DOCA/sal. Por fim, o tratamento com BE0075-1 restaurou completamente o aumento na pressão arterial, na expressão da IL-1β, PIC/PAM, o relaxamento para acetilcolina e para nitroprussiato de sódio em camundongos DOCA/sal. Por outro lado, a deleção gênica do RAG-1 preveniu completamente o aumento na pressão arterial, na expressão da caspase-1, atenuou o prejuízo na função erétil e restaurou o relaxamento para acetilcolina, mas não para nitroprussiato de sódio. Conclusão: O NLRP3 constitui-se um mecanismo importante para a gênese da DE, por meio do aumento na liberação de citocinas, recrutamento de neutrófilos e linfócitos Th1, promovidos pela ET-1 no CC. (AU)

• Processo FAPESP: 16/07641-0 - Papel do NLRP3 na disfunção erétil em modelo de hipertensão DOCA/sal e sua possível ativação por ET-1
• Beneficiário: Rafael Sobrano Fais
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado