Efeito de N-glicanas sobre propriedades funcionais de glicosil hidrolases

Autor(es)

Marcelo Ventura Rubio

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2018-07-12

Membros da banca

André Ricardo de Lima Damásio; Maria de Lourdes Teixeira de Moraes Polizeli; Marcos Silveira Buckeridge; Thamy Lívia Ribeiro Corrêa

• Orientador: André Ricardo de Lima Damásio; Fabio Marcio Squina

Resumo

O mercado de enzimas industriais abrange uma ampla variedade de aplicações, bem como: cuidados pessoais, indústria alimentícia, biocombustíveis, biopolímeros, entre outros. O principal desafio para o uso de coquetéis enzimáticos em larga escala é seu custo elevado, o que aumenta o valor final dos bioprodutos. Portanto, o custo dos bioprodutos pode ser reduzido significativamente, através do aumento do rendimento da produção de enzimas por cepas fúngicas por técnicas de biologia molecular e/ou melhorando a eficiência destas mesmas enzimas por engenharia de proteínas. Os fungos filamentosos são os principais produtores de enzimas industriais devido ao grande repertório enzimático em seu genoma e aos altos níveis de secreção de proteínas. O gênero Aspergillus inclui microrganismos que naturalmente degradam a biomassa lignocelulósica secretando grandes quantidades de enzimas ativas em carboidratos (CAZymes). A capacidade de Aspergillus de realizar modificações póstraducionais, tais como clivagem proteolítica, ligações dissulfeto e glicosilação, proporciona uma vantagem adicional à sua utilização como hospedeiro para a produção de enzimas heterólogas. No entanto, a super-expressão de proteínas sobrecarrega a via de N-glicosilação e os mecanismos de enovelamento, resultando no acúmulo de proteínas mal enoveladas ou não enoveladas. Proteínas mal enoveladas são direcionadas à degradação, consequentemente reduzindo o rendimento de sua secreção. Além disso, a posição e o número de N-glicanas ligados às proteínas podem influenciar sua secreção e propriedades funcionais. Com o objetivo de minimizar o custo de produção de enzimas, Aspergillus nidulans foi utilizado como organismo modelo para estudar o efeito da N-glicosilação na secreção de enzimas industriais. Utilizando abordagem proteômica identificou-se 265 Nglicoproteínas secretadas por A. nidulans quando cultivado em xilano e bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado. As CAZymes corresponderam a mais de 50% do secretoma e 182 sítios de N-glicosilação foram validados por LC-MS/MS. A fim de investigar a influência das N-glicosilações na secreção de proteínas em A. nidulans, uma beta-xilosidase (BxlB) da família glicosil hidrolase 3 (GH3) foi selecionada como proteína alvo devido ao seu alto nível de secreção durante o crescimento em xilano. As beta-xilosidases são hidrolases glicosídicas que auxiliam na degradação da biomassa vegetal, liberando xilose a partir de xilooligossacarídeos e/ou xilobiose. Sete sítios de N-glicosilação foram preditos em BxlB e cinco deles foram validados por LC-MS/MS. Glicomutantes foram desenhados para investigar a influência da glicosilação na secreção e função de BxlB. O mutante deglicosilado (BxlBDeglyc) apresentou resultados semelhantes em relação à secreção e atividade enzimática em comparação com a proteína selvagem (BxlBwt). Interessantemente, o mutante parcialmente glicosilado (BxlBN1;5;7) apresentou níveis aumentados de atividade e secreção. Por outro lado, o mutante BxlBCC, no qual o contexto de N-glicosilação foi alterado, foi expresso, mas não secretado em A. nidulans. BxlBwt, BxlBDeglyc e BxlBN1;5;7 mostraram estrutura secundária semelhante, embora os mutantes tivessem menor temperatura de fusão em comparação com o tipo selvagem. Além disso, um novo glicomutante mantendo apenas dois sítios de N-glicosilação (BxlBN5;7) mostrou uma melhor eficiência catalítica. Este estudo mostra a influência da N-glicosilação na função e produção de BxlB em A. nidulans, reforçando que a glicoengenharia de proteínas é uma ferramenta promissora para aumentar a estabilidade térmica, secreção e atividade enzimática. Esse trabalho, também, poderá servir de base para modificações de N-glicosilação em CAZymes para aplicações biotecnológicas (AU)

• Processo FAPESP: 13/24988-5 - Secreção de glicoproteínas heterólogas em Aspergillus: efeito do padrão de glicosilação em parâmetros funcionais de glicosil hidrolases
• Beneficiário: Marcelo Ventura Rubio
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto