Análise comparativa de diferentes sistemas de cultivo tridimensionais para estabelecimento de um modelo in vitro de câncer de bexiga para ensaios de eficácia terapêutica

Autor(es)

Robson Luis Ferraz do Amaral

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2020-07-03

Membros da banca

Kamilla Swiech Antonietto; Márcia Regina Cominetti; Silvya Stuchi Maria Engler

• Orientador: Kamilla Swiech Antonietto

Resumo

Diferentes técnicas de cultivos tridimensionais (3D) foram avaliadas a fim de estabelecer um modelo de câncer de bexiga com capacidade de recapitular in vitro características do tumor in vivo. Na primeira parte, utilizando a linhagem celular de câncer de bexiga RT4, compararam-se sistemas de cultivo 3D livres de suporte, utilizando as técnicas de flutuação forçada (Placas ULA, Ultra low attachment) e gota suspensa (Placas HD, hanging drop), e sistemas de cultivo dependentes de suporte, utilizando microcarregadores e hidrogéis (Matrigel, Alginato e HydroMatrix), quanto à formação de esferoides RT4. Estes foram caracterizados quanto aos aspectos morfológicos, de crescimento celular e metabolismo. Somente os cultivos utilizando as técnicas ULA, HD e os suportes Matrigel (50% v/v) e HydroMatrix (0,25% v/v) foram capazes de gerar esferoides com parâmetros de forma adequados (solidez > 0,95; esfericidade ~ 0,90; arredondamento entre 0,7 e 0,9). Nos cultivos ULA e HD, foi gerado um único esferoide por poço, com diâmetros entre 200 e 600 μm. O crescimento celular foi reduzido e, consequentemente, a atividade metabólica menos intensa nos esferoides quando comparados aos cultivos 2D. Os cultivos em Matrigel e HydroMatrix, por sua vez, geraram vários esferoides por poço, com diâmetros que não ultrapassaram 200 μm. Os esferoides em Matrigel apresentaram crescimento celular e metabolismo superiores aos observados nos cultivos 2D. Foram selecionados os esferoides RT4 gerados em ULA e em Matrigel para a avaliação da sensibilidade à Doxorrubicina (DOX) e da expressão de genes comumente superexpressos em tumores sólidos de bexiga. Os esferoides RT4 gerados em ULA foram menos sensíveis ao tratamento com DOX (IC50 8,62 ± 1,53 μM) do que os cultivos 2D (IC50 2,35 ± 0,39 μM) e Matrigel (IC50 3,31 ± 1,28 μM). Nos esferoides RT4 em ULA, houve maior expressão dos genes ALDH1A1 e H-RAS, dois dos principais genes envolvidos nos mecanismos de resistência e reincidência de tumores de bexiga. Já nos cultivos em Matrigel, quase todos os genes analisados foram mais expressos (HIF-1α, IFIT5, MDR-1, IL3, ALDH1A1 e H-RAS). Na segunda parte do projeto, a estratégia de cultivo em ULA com 5% Matrigel foi utilizada com sucesso para a geração de esferoides com células primárias de tumor de bexiga humano (BL0293 e BL0808) derivados de modelos PDX (patient-derived xenografts). Os perfis de sensibilidade dos esferoides BL0293 e BL0808 à Cisplatina e à Gemcitabina foram semelhantes aos obtidos previamente nos ensaios in vivo com os modelos PDX BL0293 e BL0808. De forma geral, foi possível concluir que os cultivos 3D realizados utilizando a técnica de gota suspensa em placas ULA e em Matrigel foram capazes de recapitular in vitro características do tumor in vivo, podendo ser considerados como promissores modelos 3D de câncer de bexiga. O presente trabalho traz de forma inédita uma análise comparativa entre os esferoides de tumor de bexiga gerados com diferentes técnicas de cultivo 3D em relação a morfologia e a capacidade em recapitular algumas característica do tumor in vivo. (AU)

• Processo FAPESP: 15/05102-1 - Análise comparativa de diferentes sistemas de cultivo tridimensionais para o estabelecimento de um modelo in vitro de câncer de bexiga para testes citotoxicológicos
• Beneficiário: Robson Luis Ferraz do Amaral
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto