Caracterização estrutural, funcional e análise da resposta imune in vivo de uma serinoprotease recombinante de Crotalus durissus collilineatus modificada por PEGlação

Autor(es)

Ernesto Lopes Pinheiro Júnior

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2021-02-09

Membros da banca

Eliane Candiani Arantes Braga; Veridiana de Melo Rodrigues Ávila; Flávio Henrique da Silva; Karina Furlani Zoccal

• Orientador: Eliane Candiani Arantes Braga; Johara Boldrini França

Resumo

As serinoproteases de peçonhas de serpentes (SVSPs) são enzimas capazes de afetar o sistema hemostático humano, dada sua semelhança com enzimas presentes em suas diferentes vias. Assim, são consideradas promissores agentes terapêuticos, além de potenciais ferramentas biotecnológicas. A PEGlação, processo no qual há a conjugação de polietilenoglicol (PEG) às proteínas, busca reduzir a imunogenicidade e aumentar a drogabilidade destas biomoléculas in vivo. Neste contexto, este trabalho objetivou a purificação de uma SVSP (collineina-1) da peçonha de Crotalus durissus collilineatus, bem como a expressão da sua forma recombinante (rCollineina-1) na levedura Pichia pastoris. Ambas as proteínas foram PEGladas (PEGcollineina-1 e PEG-rCollineina-1) e as características estruturais e funcionais, além da avaliação da resposta imune, foram comparadas entre as quatro formas da enzima. A collineina1 foi isolada da peçonha bruta através de dois passos cromatográficos em fase reversa, enquanto a rCollineina-1 foi purificada em três passos, em colunas de afinidade a íons metálicos imobilizados (IMAC) e troca catiônica. Em seguida, obteve-se uma população mono-PEGlada das proteínas. O modelo teórico da collineina-1 foi obtido utilizando a ferramenta SWISSMODEL, revelando que a proteína possui estrutura semelhante a outras SVSPs. A análise de estabilidade térmica indicou que todas as formas da proteína apresentam temperaturas de desenovelamento semelhantes. O pH 5,0 foi a condição com menor temperatura de desenovelamento, enquanto o pH 7,0 se caracteriza como a melhor condição para a estabilidade de todas as formas avaliadas da enzima. Foi observado um aumento significativo no tamanho das proteínas após a PEGlação (collineina-1: 4,0±0,4 nm, PEG-collineina-1: 9,9±1,1 nm, rCollineina-1: 4,9±1,3 nm; PEG-rCollineina-1: 10,7±1,3 nm). Por outro lado, não foram visualizadas mudanças expressivas no conteúdo de estruturas secundárias das enzimas. O conteúdo de alfa-hélices (7%, 5%, 2%, 15%), folhas beta (31%, 31%, 31%, 22%), giros (21%, 19%, 16%, 17%) e elementos sem conformação definida (41%, 45%, 51%, 46%) para a collineina-1, PEG-collineina-1, rCollineina-1 e PEG-rCollineina-1, respectivamente, evidenciam que a PEGlação não alterou de maneira significativa a conformação espacial das proteínas. A determinação dos parâmetros cinéticos apontou valores de Km semelhantes entre suas diferentes formas (collineina-1: 0,920±0,079 mM; rCollineina-1: 1,243±0,113 mM; PEGcollineina-1: 1,317±0,117 mM e PEG-rCollineina-1: 1,4±0,119 mM). No entanto, a constante catalítica (kcat) e a constante de especificidade (kcat/Km) foram ligeiramente diferentes. A rCollineina-1 apresentou valores mais elevados destes parâmetros (kcat=2,934±0,118 s-1 e kcat/Km = 2,4±0,115 mM.s-1 ) quando comparados à collineina-1 (kcat=0,497±0,017 s-1 e kcat/Km=0,5±0,048 mM.s-1 ), PEG-collineina-1 (kcat=0,502±0,020 s-1 e kcat/Km=0,4±0,068 mM.s1 ) e PEG-rCollineina-1 (kcat=1,286±0,050 s-1 e kcat/Km=0,9±0,084 mM.s-1 ). Estes resultados indicam que a PEGlação não foi prejudicial à atividade catalítica das formas nativa e recombinante, corroborando os resultados de degradação de fibrinogênio, os quais mostraram que todas as formas da enzima possuem atividade catalítica sobre esse substrato. Contudo, observou-se que a inibição do canal para potássio hEAG1 induzida pelas proteínas nativa e recombinante PEGladas foi significativamente menor que a inibição causada pelas enzimas não-PEGladas (45,5±13,4% para 8,2±4,7% e 50,3±6,0% para 5,7±3,7%, respectivamente, a 5 µM). Por outro lado, um aumento de atividade inibitória no hERG1 foi observado para a PEGcollineina-1 e PEG-rCollineina-1, com valores de IC50 de 22,4±1,1 µM e de 10,0±0,4 µM, respectivamente. Outras serinoproteases foram testadas em hEAG1 e os resíduos de aminoácidos essenciais para a atividade destas enzimas neste canal foram propostos. A ausência de citotoxicidade em células PBMC e a inexistência de imunogenicidade in vivo avaliada em camundongos das proteínas PEGladas são resultados importantes na busca de uma aplicabilidade terapêutica. De maneira geral, a PEGlação destas proteínas direcionou sua atividade para o controle da hemostasia, ampliando as perspectivas de serem empregadas como agentes defibrinogenantes em condições patológicas como acidente vascular cerebral, trombose e embolia pulmonar. (AU)

• Processo FAPESP: 16/04761-4 - Caracterização estrutural, funcional e análise da resposta imune in vivo de uma serinoprotease recombinante de Crotalus durissus collilineatus modificada por PEGlação
• Beneficiário: Ernesto Lopes Pinheiro Junior
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto