Estudos funcionais da proteína reguladora Ki-1/57 em células e camundongos

Autor(es)

Ângela Saito

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2015-08-13

Membros da banca

Jörg Kobarg; Deborah Schechtman; Alisson Campos Cardoso; Claudio Chrysostomo Werneck; Juliana Helena Costa Smetana

• Orientador: Jörg Kobarg; José Xavier Neto

Resumo

A proteína Ki-1/57 foi descoberta por reação cruzada do anticorpo monoclonal Ki-1 em células do linfoma de Hodgkin. A interação de Ki-1/57 com proteínas que participam da transcrição, processamento e estabilidade de RNA e tradução sugeriu seu envolvimento em mecanismos de regulação da expressão gênica. Uma proteína paráloga, CGI-55, possui alto grau de similaridade de sequência com Ki-1/57 e foi inicialmente identificada como uma proteína que regula a estabilidade de mRNA. Ki-1/57 e CGI-55 apresentam alguns parceiros de interação em comum, são metiladas por PRMT1 e podem localizar em pequenas estruturas nucleares e citoplasmáticas sob a ação de diferentes estímulos. Neste trabalho, realizou-se estudos funcionais em células humanas para o melhor entendimento do papel de Ki-1/57 e CGI-55 na regulação da expressão gênica e em mecanismos de resposta celular a estresse. Também, uma linhagem nocaute para Ki-1/57 utilizando o sistema CRISPR/Cas9 foi gerada e estudos de expressão de Ki-1/57 em tecidos murinos foram realizados. Por meio de análise de expressão gênica global em microarranjos de DNA, observou-se um papel predominantemente repressor de Ki-1/57 e CGI-55 após a superexpressão dessas proteínas em células humanas. Muitos dos genes alterados estão relacionados com vias de proliferação, apoptose e controle do ciclo celular, sugerindo uma possível relação funcional de ambas as proteínas com mecanismos de resposta celular a estresse. A superexpressão de Ki-1/57 e CGI-55 em células causou redução na proliferação, possivelmente devido a uma parada na fase G1 do ciclo celular. Ademais, quando Ki-1/57 foi superexpressa, observou-se um efeito protetor contra a apoptose após o tratamento com o indutor de estresse de retículo endoplasmático, tapsigargina. Também, observou-se que Ki-1/57 e CGI-55 são SUMOiladas, sendo que, a modificação de Ki-1/57 por SUMO foi importante para sua correta atividade de seleção do sítio de splicing do gene E1A. Ensaios de imunofluorescência mostraram que a superexpressão de Ki-1/57 em células HeLa afetou a distribuição de PML-NBs, importantes estruturas subnucleares formadas em resposta à estresses e funcionalmente relacionadas a SUMOilação e a regulação da transcrição. Em outra parte do trabalho, gerou-se uma linhagem de camundongos nocautes para Ki-1/57 através do sistema CRISPR/Cas9. O plasmídeo, que contém as informações para expressão da endonuclease hSpCas9 e do RNA guia para o exon um do gene Habp4, foi injetado em pró-núcleo de embrião de camundongo e gerou animais mosaicos. Esses animais foram acasalados com camundongos selvagens para segregar os alelos mutantes e originar as linhagens de heterozigotos. O intercruzamento entre dois heterozigotos gerou nocautes homozigotos viáveis e férteis. Ensaios de transativação do gene repórter da luciferase pelo fator de transcrição responsivo a estresse MEF2C foram realizados em cultura de células e a caracterização inicial de animais mutantes por qRT-PCR demonstram o potencial papel de Ki-1/57 na modulação da atividade transcricional de MEF2C. Portanto, essas descobertas, em conjunto, são evidências do papel de Ki-1/57 na regulação da expressão gênica e em mecanismos de resposta celular a estresse. O animal nocaute para Ki-1/57, desenvolvido neste trabalho, contribuirá para estudos futuros acerca da sua função diante de diferentes estímulos e situações estresses (AU)

• Processo FAPESP: 10/15760-2 - Caracterização funcional da proteína humana reguladora Ki-1/57: estudos celulares e em modelo in vivo
• Beneficiário: Ângela Saito
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto