Efeitos citotóxicos da 6-OHDA em neurônios dopaminérgicos são independentes da ativação da LRRK2

Autor(es)

Beatriz Pelegrini Bosque

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2021-12-08

Membros da banca

Matheus de Castro Fonseca; Mirian Akemi Furuie Hayashi; Tatiana Carla Tomiosso

• Orientador: Matheus de Castro Fonseca

Resumo

A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum no mundo, gerando debilitações progressivas para o paciente, como comprometimento motor e déficit cognitivo e psiquiátrico. Cerca de 10% dos casos registrados da doença são devido à herança genética, também chamada DP familiar, enquanto 90% possuem causas desconhecidas, ou seja, idiopáticas (iDP). Estudos sugerem que mutações em ?20 genes causam parkinsonismo genético raro, incluindo o gene que codifica a proteína quinase 2 rica em leucina (LRRK2). Até o momento, todas as mutações patogênicas nesse gene resultam na hiperativação da atividade de quinase da proteína LRRK2. Curiosamente, essa função exacerbada também já foi descrita em pacientes de DP que não portavam mutações, sugerindo que ela pode ser um fator de risco para o desenvolvimento da forma esporádica da doença. Assim, propomos avaliar possíveis alterações na localização subcelular, expressão e fosforilação da LRRK2 selvagem usando um modelo farmacológico de DP baseado na administração de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) in vitro. Inicialmente, células de neuroblastoma humano SH-SY5Y foram cultivadas em meio DMEM F/12 suplementado com 2% SFB, 1% PSA e 10?M de ácido retinóico durante 10 dias a fim de induzir um fenótipo semelhante ao de neurônios dopaminérgicos. Completada a diferenciação, essas células foram tratadas com 6-OHDA 100?M por 1hr, 4hs ou 24hs e então submetidas a ensaios de sinalização de cálcio (Ca2+) citosólico e mitocondrial, de geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e de viabilidade celular (MTS), além de avaliação da expressão/fosforilação proteica por western blot e por experimentos ex vivo de culturas organotípicas. A diferenciação foi comprovada por meio da análise da morfologia celular e da expressão de marcadores neuronais específicos, de modo que as células diferenciadas desenvolveram extensos neuritos e morfologia estrelada, além de expressarem marcadores neuronais em maior quantidade quando comparadas às células não diferenciadas. Os ensaios de sinalização de Ca2+ citosólico demonstraram que os tratamentos com 6-OHDA geraram uma resposta diminuída, bem como uma deficiência na normalização dos níveis basais de Ca2+ após estímulo, o que também foi constatado para a sinalização de Ca2+ na mitocôndria, indicando que essa organela encontra-se altamente afetada. Foi observado ainda que a 6-OHDA provocou um aumento na quantidade de ROS intracelular, o que pode ser a causa do comprometimento mitocondrial, além de ter causado redução nos níveis de viabilidade celular em relação ao controle. Ao analisarmos os efeitos da 6-OHDA sobre a LRRK2, observou-se que a 6-OHDA não alterou a expressão nem a fosforilação da proteína tanto nos neurônios dopaminérgicos quanto nas culturas organotípicas, em nenhum dos tempos de tratamento. Além disso, dois alvos conhecidos ativados pela LRRK2 (?-syn e Rab8a) também não sofreram alteração na expressão nem na fosforilação. Dessa forma, conclui-se que os efeitos citotóxicos da 6-OHDA em neurônios dopaminérgicos independem da ativação da proteína LRRK2, envolvendo assim outros mecanismos celulares (AU)

• Processo FAPESP: 19/24511-0 - LRRK2 e Rab GTPases na neurodegeneração causada pela Doença de Parkinson esporádica
• Beneficiário: Beatriz Pelegrini Bosque
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado