Estudo do equilibrio liquido-liquido, da partição de insulina e da pre-purificação da proteina de fusão precursora da insulina humana em sistemas aquosos bifasicos do tipo PEG/Sal

Autor(es)

Jose Guilherme Lembi Ferreira Alves

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Engenharia de Alimentos
• Data de defesa: 2003-03-24

Membros da banca

Antonio José de Almeida Meirelles; Adalberto Pessoa Junior; Jane Selia dos Reis Coimbra; Martín Aznar; Rahoma Sadeg Mohamed

• Orientador: Antonio José de Almeida Meirelles

Resumo

Neste trabalho foi estudada a pré-purificação da proteína de fusão precursora à insulina humana e produzida por Escherichia coli modificada, utilizando-se Sistemas Aquosos Bifásicos do tipo polietileno glicol (PEG)/sal/água. A proteína de fusão foi fornecida pela empresa farmacêutica Biobrás S.A (Montes Claros/MG) e foi dissolvida em uréia 8M. Os experimentos de partição da proteína de fusão foram conduzidos de forma a identificar condições para a separação da proteína de fusão de outras proteínas e componentes celulares de E. coli. Foram realizados dois planejamentos experimentais 32 para o estudo da partição da proteína de fusão precursora da insulina humana no sistema PEG/fosfato de potássio/água. tendo-se como variáveis a massa molar do polietileno glicol, a razão mássica PEG/fosfato do sistema (RPEG/FOS). OS níveis estudados foram 1500, 3350 e 8000 para a massa molar do PEG; 1,6, 1,636 e 1,67 para RPEG/FOS. No primeiro planejamento, os testes de partição foram conduzidos a pH 9, enquanto que no segundo planejamento, os testes foram conduzidos a pH 12. Concluídos os testes com o sistema PEG/fosfato de potássio/água, foi escolhida a melhor condição para a purificação da proteína de fusão, condição esta que foi também testada para o sistema PEG/citrato de sódio/água. Para o sistema PEG/fosfato de potássio/água, o melhor resultado foi obtido com o PEG de massa molar 1500, concentração de 16% p/p PEG/l0% p/p de fosfato e pH 9, com fator de purificação da ordem de 1,5 vez e recuperação de 99%. Nestas mesmas condições, mas utilizando citrato de sódio, o fator de purificação e a recuperação foram 1,8 vez e 50,0%, respectivamente. Para analisar a proteína de fusão precursora da insulina humana, desenvolveu-se uma metodologia de análise por Cromatografia de afinidade / FPLC, usando-se a coluna Chelating Sepharose para separar a proteína de fusão dos demais componentes celulares e o Método de Bradford para quantificá-1a. Diagramas de fase do sistema PE& Na3Cit/H2O, para 3 pesos moleculares de PEG (600, 1500 e 3000) foram medidos a 25°C e modelou-se o equilíbrio líquido-líquido deste sistema usando-se o modelo VERS, baseado na equação do virial e que usa como medida de concentração uma fração de superfície externa do componente. Um ajuste muito bom aos dados experimentais foi obtido e os erros absolutos médios entre as concentrações experimentais dos componentes e as calculadas pelo modelo VERS foram 1,16%, 1,05% e 1,19% para os sistemas PEG600/ Na3Cit/H2O, PEGl500/ Na3Cit/H2O e PEG3000/ Na3Cit/H2O, respectivamente. O modelo obtido apresentou boa capacidade preditiva para a influência da massa molar do PEG sobre o equilíbrio líquido-líquido do sistema estudado. Para fins de modelagem termodinâmica, também foi estudada a partição das insulinas humana e suína puras nos sistemas PEG600/ Na3Cit/H2O, PEG1450/Na3Cit/ H2O e PEG3350/Na3Cit/ H2O em pH 4,5, 7 e 9,5 a 25°C para modelar a partição da insulina no sistema PEG/ Na3Cit/ H2O, utilizando-se também o modelo VERS e bons resultados foram obtidos para a -predição do coeficiente de partição da insulina suína no sistema PEG/ Na3Cit/H2O a pH 7,0 (AU)

• Processo FAPESP: 97/05405-4 - Pré-purificação da proteína de fusão precursora da insulina humana obtida pelo método de DNA recombinante, utilizando-se de sistemas aquosos bifásicos
• Beneficiário: Jose Guilherme Lembi Ferreira Alves
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado