Estudos funcionais do sistema de secreção do tipo VI de Chromobacterium violaceum

Autor(es)

Júlia Aparecida Alves

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2024-05-24

Membros da banca

José Freire da Silva Neto; Shaker Chuck Farah; María Eugenia Guazzaroni; Frederico José Gueiros Filho

• Orientador: José Freire da Silva Neto

Resumo

Bactérias possuem sistemas de secreção para a translocação de proteínas, como toxinas e outros fatores de virulência, através da membrana celular para o meio externo ou para o interior de células alvo. O sistema de secreção do tipo VI (T6SS) é uma maquinaria contráctil de bactérias Gram-negativas que dispara proteínas efetoras diretamente dentro de células alvo. A secreção ocorre pela contração da bainha VipAB que leva a propulsão do tubo Hcp ao qual estão associadas proteínas VgrG/PAAR e os efetores. O T6SS secreta toxinas antibacterianas durante competição entre bactérias e efetores que subvertem funções de células hospedeiras. Neste trabalho, caracterizamos o T6SS de Chromobacterium violaceum, uma bactéria Gram-negativa ambiental e patógeno oportunista em humanos. Nós identificamos no genoma de C. violaceum um cluster gênico principal e clusters menores que codificam os componentes do T6SS. A funcionalidade do T6SS foi avaliada por microscopia de fluorescência de sfGFP fusionada a VipA, pela secreção de Hcp e por ensaios de competição contra outras bactérias, usando C. violaceum selvagem e mutantes do T6SS. Os dados indicaram que o T6SS é ativo em condições de cultivo laboratorial em baixa densidade celular, fundamental na competição de C. violaceum contra outras bactérias, mas dispensável para virulência em camundongos. A regulação do T6SS foi estudada pela análise da atividade dos promotores do cluster principal. Nossos dados indicaram que a regulação transcricional depende da fase de crescimento e de CviR, o regulador global de quorum sensing (QS). Consistente com estes dados, e deleção de cviR reduziu a produção e aboliu a secreção de Hcp, além de cessar os disparos do T6SS e reduzir fortemente a capacidade de C. violaceum competir contra outras bactérias. Mutação de cviI, que codifica a enzima produtora de indutores do QS, praticamente não afetou o T6SS, indicando uma atuação não canônica do sistema de QS CviIR no T6SS. Para identificar o arsenal de efetores do T6SS de C. violaceum foram realizadas análises proteômicas por espectrometria de massas comparando o sobrenadante da linhagem selvagem com o sobrenadante de mutante do T6SS, além de análise por co-imunoprecipitação de VgrG3. Estes ensaios permitiram identificar como efetores do T6SS três fosfolipases da família Tle1, uma da família Tle5, uma proteína hipotética (CV_2125) e uma proteína Rhs (CV_1431), nomeada RhsF (Rhs contendo motivo FIX). As proteínas da família Rhs são toxinas polimórficas. Nós demonstramos que RhsF é uma toxina antibacteriana, pois a expressão controlada de seu domínio C-terminal (RhsF-CT) causou a morte de Escherichia coli. A co-expressão de RhsF-CT com RhsI, uma proteína codificada pelo gene seguinte a rhsF, aboliu a toxicidade de RhsF em E. coli, indicando que RhsFI compõe um par toxina/antitoxina. Ensaios de competição intraespécies contra linhagens com deleção em rhsFI confirmaram que RhsF é secretada pelo T6SS, e ensaios de competição interespécies mostraram que RhsF é de fato um efetor importante na competição contra outras bactérias. Análise da estrutura predita de RhsF e da estrutura determinada por cristalografia de raio-X do complexo RhsF-CT/RhsI indica que RhsF é possivelmente uma ADP-ribosiltransferase, cuja atividade tóxica é neutralizada por RhsI via obstrução do sítio catalítico da toxina. Ensaios com NAD+ biotinilado sugerem que RhsF ribosila proteínas. Juntos, os resultados desse trabalho permitiram determinar a importância do T6SS na biologia de C. violaceum, identificar vários efetores do T6SS e caracterizar um novo par toxina/antitoxina antibacteriano da família Rhs. (AU)

• Processo FAPESP: 18/03979-1 - Estudos funcionais do sistema de secreção do tipo VI de Chromobacterium violaceum
• Beneficiário: Júlia Aparecida Alves
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto