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Caracterização enzimática das celulases XF-810, XF-818 e XF-2708 de Xylella fastidiosa e purificação da proteína XF-818, expressas em Escherichia coli.

Texto completo
Autor(es):
Nelson Arno Wulff
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Tese de Doutorado
Imprenta: Piracicaba.
Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz
Data de defesa:
Membros da banca:
Sergio Florentino Pascholati; Eleonora Cano Carmona; Helaine Carrer; Antonio Vargas de Oliveira Figueira; Marcio Rodrigues Lambais
Orientador: Sergio Florentino Pascholati
Resumo

A bactéria Xylella fastidiosa causa a clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Em 2000, foi concluído o seqüenciamento do genoma deste organismo, o primeiro de uma bactéria fitopatogênica, um fato que estimulou o estudo dos possíveis mecanismos de patogenicidade empregados pela bactéria para causar a doença em citros. X. fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema, sendo transmitida de planta a planta através de insetos vetores. Especula-se que a bactéria produza enzimas que degradem a membrana da pontuação, permitindo a colonização de novos vasos do xilema. A identificação de genes com similaridade de seqüência a genes de celulases, xilanases, pectinases e proteases, fomentou o presente estudo visando caracterizar os genes Xf – 810, Xf – 818 e Xf – 2708, similares a endoglicanases. Estes genes foram clonados em vetores de expressão e as respectivas proteínas foram produzidas em Escherichia coli. Através de ensaios enzimáticos as proteínas foram caracterizadas como endoglicanases (EC 3.2.1.4), que são celulases com mecanismo endoglicolítico de ataque às moléculas de celulose. Estas celulases hidrolisam carboximetil celulose, Avicel e xilana, enquanto as enzimas Xf – 810 e Xf – 818 hidrolisam a celulose amolecida com ácido. Estas celulases degradam mais eficientemente a carboximetil celulose em pH ácido (entre 5,2 e 5,6) e na temperatura de 65 °C. Coletivamente, estas celulases são capazes de degradar polímeros solúveis e insolúveis, enquanto a enzima Xf – 818, é capaz de degradar oligossacarídeos derivados da celulose, como celotetraose e celopentaose, apresentando ampla variação catalítica. Esta celulase possui capacidade de ligação à celulose microcristalina, denotando a funcionalidade de seu domínio ligador de celulose. Desenvolvemos um protocolo, empregando cromatografia de troca aniônica, afinidade por metal (níquel) e filtração em gel, eficiente na purificação da proteína Xf – 818 expressa heterologamente em E. coli com fusão hexahistidina à extremidade N–terminal. A caracterização enzimática destas proteínas, com a confirmação da atividade celulásica, fornece subsídios para uma eventual função das celulases durante a colonização do hospedeiro pela bactéria, pois são cataliticamente funcionais. Ademais, corrobora a similaridade destes genes, verificada durante o seqüenciamento do genoma de X. fastidiosa. (AU)

Processo FAPESP: 98/16459-0 - Clonagem, expressão e caracterização de celulase(s) e liase(s) do pectato de Xylella fastidiosa
Beneficiário:Nelson Arno Wulff
Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Doutorado