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Ressonância magnética nuclear na determinação de estrutura de proteínas: aplicação à mutante His15Ala de HPr de Staphylococcus aureus

Texto completo
Autor(es):
Claudia Elisabeth Munte
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Tese de Doutorado
Imprenta: São Carlos.
Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Física de São Carlos
Data de defesa:
Membros da banca:
Richard Charles Garratt; Fabio Ceneviva Lacerda de Almeida; Luiz Alberto Colnago; Glaucius Oliva; Otavio Henrique Thiemann
Orientador: Richard Charles Garratt
Resumo

A técnica de espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear (NMR) de alta resolução foi utilizada para estudos estruturais em duas biomoléculas: a proteína HPr da bactéria Staphylococcus aureus, e o peptídeo C da insulina humana. Ambas estão relacionadas com a regulação da absorção de glicose pelas células, no primeiro caso em procariontes, e no segundo em organismos superiores. A proteína HPr (\"Histidine-containing protein\") de Staphylococcus aureus é uma das componentes centrais do sistema PTS (fosfoenolpiruvato:açúcar-fosfotransferase) de translocação grupal, responsável pelo transporte ativo de açúcar para o interior da célula bacterial. Nesse processo, a His15 do sítio ativo de HPr é fosforilada pela enzima EI, transferindo, a seguir, o grupo fosfato para a enzima EUA A mutação His15&#8594Ala interrompe a transferência do grupo fosfato; apesar disso, a afinidade entre HPr(H15A) e as enzimas EI/EIlA se mostrou semelhante à da nativa. Utilizando técnicas de NMR bidimensionais (COSY, TOCSY, NOESY, HSQC) etridimensionais (HNCA, HNCO, NOESY-HSQC) foi determinada a estrutura da mutante His15&#8594Ala de HPr de S. aureus. Sua estrutura consiste de um sanduíche-aberto, composto de 3 hélices-a paralelamente empacotadas contra uma folha formada por 4 fitas-&#946 anti-paralelas. Esse padrão é encontrado em todas as proteínas HPr já determinadas em diversas espécies, divergindo, porém, significativamente da estrutura previamente publicada para a proteína nativa de S. aureus com relação à orientação relativa de alguns elementos de estrutura secundária. Através de uma análise detalhada dos espectros NOESY das proteínas HPr mutante e nativa puderam ser encontradas diferenças conformacionais na região em tomo do sítio-ativo. Uma comparação com as outras estruturas de HPr já publicadas revelou uma maior semelhança entre a proteína mutante de S. aureus e a proteína no complexo HPr/EI de E. coli, fornecendo evidências de que a estrutura encontrada para a mutante represente a conformação assumida pela proteína HPr no momento de sua interação com a enzima EI, assim explicando a sua afinidade inalterada. O peptídeo-C da proinsulina é importante para a biosíntese da insulina, tendo sido considerado, por muito tempo, biologicamente inerte. Estudos recentes em pacientes diabéticos retomaram a discussão quanto a sua possível atividade reguladora. Utilizando a técnica de espectroscopia de NMR bidimensional (COSY, TOCSY, NOESY), foram realizados estudos estruturais no peptídeo-C da proinsulina humana. Quando dissolvido em 50%/50% água e TFE, o peptídeo-C apresentou 3 regiões centrais (9-12, 15-18, 22-25) com tendência à formação de dobras, uma região N-terminal (2-5) com 2 conformações em voltas-&#946 tipo I e I, e uma região Cterminal (26-31), de conformação extremamente bem definida, incluindo uma volta-&#946 tipo III\' (27-30). Em estudos descritos na literatura já foi demonstrada a atividade do pentapeptídeo C-terminal (EGSLQ), na forma de interações quirais com um receptor ainda desconhecido. Estudos anteriores por NMR prevêem a existência de uma estrutura na região C-terminal, a qual foi denominada de \"CA-Knuckle\". Nossa proposta é que a estrutura aqui obtida para o pentapeptídeo C-terminal seja justamente o \"CA-Knuckle\", representando o sítio-ativo do peptídeo-C da proinsulina humana. (AU)

Processo FAPESP: 96/12386-3 - Ressonância magnética nuclear na determinação de estrutura de proteínas: aplicação a mutantes de HPr de Staphylococcus aureus
Beneficiário:Claudia Elisabeth Munte
Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Doutorado