Analise da estrutura tridimensional da L-aminoácido oxidase de Bothrops atrox e suas interações biológicas in vitro e in vivo

Autor(es)

Raquel de Melo Alves Paiva

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2011-04-01

Membros da banca

Suely Vilela; Eliane Candiani Arantes Braga; Fabíola Attié de Castro; Jose Roberto Giglio; Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro

• Orientador: Suely Vilela

Resumo

O presente trabalho apresenta a determinacao da estrutura tridimensional da L-aminoacido oxidase do veneno de Bothrops atrox (BatroxLAAO) e sua avaliacao como potencial agente biotecnologico. Quanto a caracterizacao estrutural, a enzima BatroxLAAO (6 mg/mL) foi submetida a varios screenings e, por meio destas variacoes, obtivemos um resultado ideal para o crescimento dos monocristais sob a condicao de 0,05 M de sulfato heptahidratado de zinco, 15% (v/v) de Polietilenoglicol monometil eter 550, controle de pH 5 com 0,1M de cacodilato de sodio. A utilizacao de parafina e silicone resultou na melhora dos cristais, revelando cristais unicos e de coloracao amarela, o que permitiu o melhor crescimento e difracao desses cristais, a 2,3 .. Estes dados permitiram a determinacao de estrutura terciaria de BatroxLAAO e, portanto, melhor entendimento dos mecanismos de atuacao da mesma. A proteina foi obtida, atraves de passos cromatograficos, com rendimento medio de 1,54% do veneno bruto. Esta apresentou acentuada inibicao da proliferacao celular de celulas tumorais HL-60, JURKAT, PC12 e B16F10, principalmente nas maiores concentracoes (50 e 100 Êg/mL). Ainda, o tratamento de celulas PBMC com BatroxLAAO, demonstrou baixa citotoxicidade em relacao ao tratamento das celulas tumorais. A viabilidade celular da Leishmania sp. foi analisada apos o tratamento com BatroxLAAO. A adicao de BatroxLAAO diretamente as formas promastigotas de diferentes especies de Leishmania resultou em morte dos parasitas de forma dose-dependente. As especies L. major e L. donovani foram as mais susceptiveis ao efeito toxico de BatroxLAAO. O efeito toxico apresentado pela BatroxLAAO foi quase completamente abolido pela adicao de catalase, sugerindo que a liberacao de H2O2 esta diretamente envolvida com o efeito da enzima. A atividade bactericida foi avaliada pela inibicao do crescimento das cepas de E. coli e S. aureus apos tratamento com a BatroxLAAO. A proteina (37,5 Êg/mL) apresentou alta atividade fungicida contra Candida albicans, com 100% da inibicao do crescimento das cepas. Foi avaliada a atividade tripanomicida, onde BatroxLAAO mostrou-se potencialmente ativa sobre T. cruzi. Foram realizados experimentos para a producao de anticorpo monoclonal (anti-BatroxLAAO). O anticorpo produzido apresentou reatividade ate diluicao 1:60000. No entanto, apos a realizacao do teste de ELISA com o anticorpo produzido e outras L-aminoacidos oxidases de diferentes venenos de serpentes, averiguamos que o anti-BatroxLAAO nao tem especificidade unica, ocorrendo reatividade para todos os venenos e proteinas testadas. Foram realizados ensaios in vivo para a deteccao da expressao dos genes FAS, BAX e BCL2. Os dados obtidos sugerem que BatroxLAAO apresenta potencial biotecnologico bastante evidente nas acoes leishmanicida e fungicida, bem como na atividade antitumoral, in vitro, mostrando-se um composto com potencial agente terapeutico. (AU)

• Processo FAPESP: 07/51700-1 - Análise da estrutura tridimensional da L-aminoácido oxidase de Bothops atrox e suas interações in vitro e in vivo
• Beneficiário: Raquel de Melo Alves Paiva
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado