Clonagem, expressão e purificação de domínios da proteína AtRLI2 (RNase L Inhibitor), um supressor endógeno de silenciamento por RNA de Arabidopis thaliana, visando estudos estruturais

Autor(es)

Edmárcia Elisa de Souza

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Botucatu. 2014-06-11.
• Instituição: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Instituto de Biociências. Botucatu
• Data de defesa: 2010-01-28
• Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes; Antonio Sérgio Kimus Braz

Resumo

A RNase L inhibitor (RLI) é uma proteína altamente conservada em Eukatyota e Archaea e foi primeiramente identificada em humanos, onde se mostrou reguladora da via 2'-5' - oligoadenilato sintetase/ribonuclease L (OAS/RNase L), principal via induzida por interferon. Novas funções têm sido descritas para RLI em diferentes organismos, dentre elas o controle do silenciamento por RNA e resistência a vírus. Visando futuros estudos estruturais foi possível subclonar a sequência que codifica para o domínio NBDs (Nucleotide Binding Domain) de AtRLI2 de Arabidopsis thaliana em vetor de expressão pET-28a(+) capaz de expressar a proteína NBDs ligada a um His6 tag. A proteína NBDs foi expressa e purificada por cromatografia de afinidade por níquel em condição nativa utilizando detergente N-lauril-sarcosil, com um rendimento da ordem de 8 mg/L e em condição desnaturante utilizando uréia, com um rendimento da ordem de 10 mg/L. Para renaturação da proteína utilizou-se dATP e cloreto de magnésio com posterior diálise obtendo-se uma diminuição significativa dos corpúsculos de inclusão e o aumento da solubilidade da proteína produzida em condição desnaturante. Para confirmar a presença dos resíduos His6 tag em fusão com a proteína NBDs, testes de Western blot foram realizados utilizando extrato total das células induzi das, a proteína purificada e a proteína originada da diálise. Foi possível concluir que houve o reconhecimento do anticorpo monoclonal anti-HiS6 tag à proteína confirmando o sucesso da obtenção e purificação da proteína fusionada à uma sequência de 6 histidinas. Etapas posteriores de purificação, a partir da proteína NBDs obtida, necessitam ser realizadas a fim de obter a proteína com grau de pureza significativo e em quantidades suficientes para a realização dos ensaios biofisicos e cristalográficos (AU)

• Processo FAPESP: 07/52895-0 - Expressão, purificação e teste de cristalização de proteína atrl12 (RNase l inhibitor) de Arabidopsis thaliana, uma supressora de silenciamento por RNA
• Beneficiário: Edmarcia Elisa de Souza
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado