Expressão em E. coli e purificação de mutantes de bothropstoxina-I do veneno de B. jararacussu e mapeamento de superfície através de mutagênese sítio dirigida de triptofanos

Resumo

A bothropstoxina I (BthTX-I) é uma PLA2-Lis49 isolada do veneno de Bothrops jararacussu que apresenta uma substituição do aminoácido ácido aspártico por lisina na posição 49 do sítio ativo. Esta substituição impede a ligação do cofator Ca2+, com a conseqüente perda do ciclo catalítico produtivo. Embora sem atividade catalítica fosfolipásica, a interação da PLA2-Lis49 com lipossomos de composição lipídica provoca uma liberação rápida do conteúdo aquoso dos lipossomos por um mecanismo independente do Ca2+ que ainda é pouco conhecido. Utilizando a BthTX-I como um sistema modelo, pretende-se investigar as bases estruturais do mecanismo de danificação à membrana pelas PLA2-Lis49. O cDNA da BthTX-l foi isolado e sequenciado (Ward et al, 1995) e recentemente a proteína foi expressa em E. coli e purificada (Ward et al, 2001). Utilizando-se a técnica de mutagênese sitio-dirigida pretende-se produzir uma série de proteínas recombinantes com triptofanos únicos em diferentes regiões da molécula. À fluorescência intrínseca dos triptofanos será utilizada para avaliar o modelo proposto através do estudo das mudanças conformacionais da proteína em solução bem como quando em associação com membranas artificiais. (AU)