Investigação da relação entre estrutura e função em fosfolipase lisina 49

Resumo

As fosfolipases A2 (PLA2) catalisam a hidrólise de pontes ácido-éster na posição sn-2 dos fosfolipídeos, liberando ácidos graxos e lisofosfolipídeos. Esses produtos de hidrólise servem como substratos para a produção de ácido aracadônico e têm um padrão na regulação da resposta inflamatória e agregação de plaquetas. Tais funções regulatórias fazem com que as PLA2 sejam um alvo em potencial para a intervenção química no tratamento de doenças como artrite. Nesse sentido, o entendimento das interações proteína/lipídeo é essencial para o desenvolvimento de novos medicamentos. As PLA2 apresentam um alto grau de homologia, no nível de sequência de aminoácidos, e as comparações das diferentes sequências de aminoácidos revelaram que os resíduos envolvidos no sítio ativo são conservados. O resíduo Asp49 mostrou estar envolvido na ligação de cálcio, o que serve como um cofator na catálise e, na ausência deste íon, as PLA2s são inativas. Varias PLA2 foram isoladas a partir de venenos de serpentes Bothrops que perderam ou apresentam atividade catalítica extremamente baixa, e as sequências de aminoácidos dessas PLA2s revelaram que o Asp49 está substituído por uma lisina. A consequência dessa substituição é a perda da capacidade de ligação do cofator Ca2+, o que leva à ausência de atividade catalítica. Apesar de não apresentar atividade enzimática, a interação da PLA2-Lys49 com lipossomos de composição lipídica variada provoca uma liberação rápida do conteúdo aquoso dos lipossomos. Este processo é independente de íons cálcio e ocorre sem hidrólise fosfolipídica detectáve1. Utilizando a BthTxI de Bothrops jararacussu como um sistema-modelo, pretendemos investigar as bases estruturais do mecanismo que resulta em dano à membrana por PLA2-Lys49, combinando técnicas de biologia molecular e espetrofluorimetria. O sistema de expressão de BthTxI em E. coli, bem como o protocolo de purificação da proteína recombinante encontram-se estabelecidos. No presente projeto, pretendemos empregar mutagênese sítio-dirigida para gerar mutações pontuais na BthTxI. Após a obtenção de proteínas mutantes purificadas, os efeitos causados pelas mudanças na estrutura e na função da proteína serão avaliados utilizando-se diferentes técnicas de fluorescência. Bicamadas lipídicas artificiais foram muito usadas em estudos de interações entre proteínas e membranas. Lipossomas apresentam um modelo de membrana com as vantagens da simplicidade de preparação, facilidade para variar a composição de membrana e flexibilidade em termos de uso. Historicamente, o estudo das interações de PLA2 com lipídios empregou bicamadas lipídicas não hidrolisáveis e inibidores de catálise. As PLA2-Lys49 oferecem a possibilidade de estudar a interação da PLA2 com lipídeos naturais, sem os problemas associados com hidrólise e esgotamento das bicamadas. (AU)