Analise molecular e ultraestrutural da via de secrecao nao convencional das endooligopeptidases neurolisina (ec3.4.24.16) e "thimet oligopeptidase" (ec3.4.24.15).

Resumo

Nesse projeto estamos propondo estudar a via de secreção alternativa das endooligopeptidases neurolisina (EC 3.4.24.16) e thimet-oligopeptidase (EC 3.4.24.15), uma vez que as mesmas são produzidas sem um peptídeo sinal de entrada convencional no retículo endoplasmático rugoso. Para que possamos entender esse mecanismo secretório, pretendemos transfectar células secretoras com essas endopeptidases modificadas estruturalmente, através de manipulação do cDNA correspondente. A princípio propomos gerar hemi-enzimas com deleções na região amino-terminal, e posteriormente através de mutações sítio-dirigidas, pretendemos caracterizar os aminoácidos importantes no processo de secreção dessas duas endopeptidases. Essas construções serão transfectadas em células secretoras AtT20 de pituitária anterior de camundongo e por imunocitoquímica para microscopia confocal e/ou eletrônica de transmissão, poderemos correlacionar os efeitos das alterações estruturais sobre a localização subcelular dessas enzimas. A presença dessas enzimas (contendo ou não deleções e/ou mutações) no meio de cultura (secreção) será avaliada por medida da atividade enzimática e/ou Western blot. (AU)