Análise funcional de mutantes da EP24.15 (EC 3.4.24.15) com capacidade reduzida de interação à membrana plasmática

Resumo

Pretendemos dar prosseguimento ao nosso projeto de mestrado onde demonstramos que o íon cálcio induz mudanças conformacionais na estrutura da EP24.15, provavelmente mediadas pelo resíduo D93. Esse mesmo resíduo foi demonstrado ser responsável pela interação cálcio-dependente da EP24.15 com a membrana plasmática. Para complementar nosso projeto pretendemos incluir os seguintes objetivos: 1) determinar o número de sítios de ligação para cálcio presentes na EP24.15, por meio de experimentos com 45Ca2+ e de titulação por espectroscopia de fluorescência, 2) transfectar células secretoras HEK293 com os mutantes D93A e D159A no intuito de investigar o comportamento secretório desses mutantes em relação à enzima selvagem e 3) analisar a curva de crescimento de células C6 de glioma de rato, assim como das células HEK293, que expressam naturalmente a EP24.15, após tratamento dessas com o inibidor da EP24.15, JA2. Como esse inibidor não é degradado no meio extracelular nem é permeável às células, dará um indício apenas da participação da enzima secretada sobre o crescimento celular. Ainda nesse objetivo, temos o intuito de analisar o conteúdo de peptídeos no meio extracelular de células tratadas ou não com o inibidor da EP24.15 por espectrometria de massa, utilizando procedimento recentemente desenvolvido em nosso laboratório. (AU)