Expressão do sistema retroviral pCLpG medido em recipientes de transplante de medula óssea

Resumo

O retro vírus é uma ferramenta de transferência gênica largamente utilizada em ensaios de laboratório e em protocolos clínicos. Vários protocolos de sistemas retrovirais vêm sendo desenvolvidos para protocolos de aplicação ex vivo e in vivo. Desenvolvemos um novo vírus, chamado pCLPG, com expressão viral sob comando do p53, um supressor de tumor e um ativador indutível de transcrição, já verificado em cultura de células. Pretendemos caracterizar e validar a expressão do sistema pCLPG in vivo, utilizando um modelo animal de transdução de células da medula óssea (CMO) do camundongo C57BL/6 seguido por transplantação em animais recipientes previamente irradiados para abolir o sistema hematopoiético. Com o transplante, o sistema hematopoiético será reconstituído com o CMO transduzido. A expressão do eGFP será detectada por citometria de fluxo em células do CMO, sangue, timo e baço recuperado dos recipientes. Pretendemos recolher DNA genômico destas células para avaliação da inserção do provírus, medindo o número de cópias inseridas e identificando o sítio de integração. Se for bem sucedido, esperamos observar que o sistema pCLPG expressará o gene repórter mesmo depois da diferenciação das células tronco transduzidas, com integração de 1 até 3 provírus por célula, não sofrendo metilação, e não provocando proliferação clonal. Esperamos observar que o vírus parental e não modificado, pCLeGFP, não será expressado nos recipientes devido à metilação do LTR. A validação do sistema pCLPG em modelos animais, exaustivamente estudada e bem sucedida suporta a indicação de que estes vírus poderão ser desenvolvidos para aplicação em futuros protocolos. (AU)