Splicing alternativo: integração de estratégias computacionais para a caracterização funcional de variantes identificados por mutações em sítios reguladores de splicing em tumores de cólon, mama e glioblastomas

Resumo

Alguns variantes de splicing estão associados com a dispersão e a progressão de diversos tumores humanos, e dessa maneira, podem ser alvos importantes no diagnóstico e na terapia contra o câncer. Este projeto de pesquisa pretende explorar os dados de estratégias computacionais desenvolvidas no laboratório de Bioinformática do Instituto Ludwig - São Paulo, as quais identificaram possíveis novas seqüências reguladoras de splicing e variantes de splicing diferencialmente expressos em tumores. Pretendemos integrar essas estratégias para caracterizar funcionalmente variantes gerados por mutações somáticas existentes em elementos regulatórios de splicing de 13.000 genes de tumores de cólon e mama e de 20 genes de receptores de tirosina-quinase presentes em gliobastoma. As mutações serão selecionadas quanto ao maior ou menor interesse neste projeto, baseando-se no maior ou menor efeito da mutação no elemento regulador, na ontologia do gene (genes envolvidos com câncer e fatores de splicing serão preferencialmente escolhidos) e no grau de diferença de expressão gênica do variante em tumores e tecidos normais. Confirmaremos se os variantes são diferencialmente expressos e se a mutação altera o splicing através de ensaios de splicing in vivo. Os candidatos mais interessantes serão analisados funcionalmente a fim de se estudar o papel do variante e sua possível associação com o tumor, através de ensaios de super-expressão e de interferência de RNA analisando-se o fenótipo dos transfectantes através de ensaios de proliferação celular, ensaios clonogênicos, ensaios de migração celular e localização celular. No caso de selecionarmos mutações em fatores de splicing, células que super-expressem ou células RNAi para este fator, serão analisadas também quanto ao padrão de expressão gênica de diversos variantes de splicing em ensaios de microarray desenhados para detecção de variantes de splicing em larga-escala. (AU)