Estrutura e reatividade de hemoproteínas, hemopeptídeos e porfirinas em meios homogêneos e heterogêneos: aspectos básicos e aplicados à nanotecnologia

Resumo

Este projeto abrange o estudo de vários aspectos da estrutura e da reatividade de citocromo c, HRP, microperoxidases e porfirinas na presença e na ausência de micelas, membranas e partículas. Este projeto inclui também estudar a interação e a reatividade dos citocromos respiratórios com lipídeos de membrana em lipossomos modelo e mitocôndrias isoladas. Portanto, o presente projeto possui duas grandes metas: desenvolver e estudar sistemas catalíticos com interesse na área básica e aplicada à nanotecnologia e estudar os mecanismos de interação de citocromo c com membranas biológicas e como isto afeta suas funções e susceptibilidade a danos por espécies excitadas e radicalares. Para atingir esses objetivos utilizaremos técnicas físicas, químicas e métodos computacionais. Os principais estudos para atingir esses objetivos serão: 1- Estudo de sistemas catalíticos contendo porfirinas como centro ativo envolvendo estrutura e função de HRP, microperoxidases e porfirinas em meios homogêneos bem como associadas a interfaces catiônicas, nanotubos de carbono, nanotubos de TiO2 e à sílica mesoporosa MCM-41. 2- Interação de citocromo c com modelos de membrana mitocondrial interna e seus efeitos sobre a reatividade e a susceptibilidade da hemoproteína às espécies excitadas e radicalares. Especificamente serão abordadas as seguintes as questões descritas a seguir. a) Estudo das interações eletrostática e lipídeo estendida dos sítios A e L de citocromo c com modelos de membrana interna mitocondrial contendo lipídeos íntegros e oxidados por radicais livres e por oxigênio singlete. b) Efeito de citocromo c na geração de oxigênio singlete a partir de cardiolipina oxidada: participação dos mecanismos de Russell e transferência de energia a partir de carbonilos tripletes. c) Efeito fotodinâmico de fenotiazinas sobre citocromo c livre e associado a lipossomos. 3- Perfil evolutivo das mudanças estruturais que permitiram a participação de citocromo c na apoptose. A literatura carece de estudos mais sistemáticos que comprovem quais aquisições ou perdas estruturais dotaram citocromo c da capacidade de induzir apoptose. Para tanto, pretendemos clonar e expressar citocromo c dos procariotos Paracoccus c550, Rhodospirillum c2 e Chlorobium c555, de eucariotos Euglena (protozoário), Neurospora (fungo), Drosophila (inseto), Thunnus (peixe), Xenopus (anfíbio), Cheloniidae (réptil), Gallus (ave), promover a microinjeção dessas moléculas de citocromo c em células de aorta de coelho e monitorar a capacidade das mesmas de induzir apoptose por meio de análise por microscopia de fluorescência e confocal. De acordo com os resultados obtidos, promoveremos mutações sítio específicas em citocromo c de cavalo para determinar as mudanças estruturais que foram cruciais para que citocromo c pudesse desempenhar a função pró-apoptótica além do transporte de elétrons na cadeia respiratória. Esses estudos serão complementados com a capacidade desses citocromos de induzir ativação de caspases em extratos das células de aorta de coelho, por meio do uso de substrato fluorescente, bem como a capacidade de induzir vazamento lisossomal, por meio de microscopia confocal. O estudo da capacidade de citocromos de procariotos disparar apoptose se justifica pelo fato de que são estruturalmente relacionados ao citocromo c eucariótico. Ao contrário do citocromo c eucariótico, os de procarioto exibem considerável variabilidade de sequência e de tamanho da cadeia polipeptídica. Apesar de apresentarem essa variabilidade, suas estruturas de raio X são muito semelhantes, com aminoácidos aromáticos na cavidade do grupo heme e "clusters" de resíduos de lisina ao redor da cavidade do grupo prostético. Além disso, outra discussão ainda persiste na literatura envolvendo o papel que a atividade redox de citocromo c poderia exercer no processo de apoptose e esse aspecto também será abordado pela técnica de microinjeção associado à capacidade de promover externalização de fosfatidilserina. (AU)