Identificação e caracterização de ligantes da proteína Ndel1 (Nuclear distribution Element-Like), análise da regulação promotora e caracterização funcional da atividade enzimática

Resumo

A Ndel1 foi isolada pela primeira vez do citosol de cérebro de coelho em meados da década de 70, utilizando a bradicinina como substrato. Posteriormente, foi a primeira enzima a apresentar seletividade por oligopeptídeos a ser descrita. A caracterização bioquímica da Ndel1 permitiu determinar que esta enzima é uma endopeptidase tiol-ativável, insensível ao EDTA, capaz de hidrolisar seletivamente peptídeos de 7 a 13 resíduos de aminoácidos. Coincidentemente, trabalhos independentes, visando o estudo de doenças neurodegenerativas, realizado por outros grupos no exterior, também levaram à identificação Ndel1, demonstrando que esta proteína apresentando atividade enzimática com especificidade por oligopeptídeos também está envolvida na formação do SNC [Hayashi e cols. (2005) PNAS]. A geração de mutações pontuais e a expressão da respectiva proteína recombinante possibilitaram determinar que a atividade enzimática da Ndel1 é dependente de um resíduo de cisteína localizado na posição 273, confirmando sugestões anteriores de que a Ndel1 é uma enzima tiol-ativável. Além disto, foi demonstrado ainda que esta atividade enzimática pode ser regulada pela interação com proteínas presentes no cérebro, como a Disc1 (Disrupted-in-Schizophrenia 1). A presença de mutações neste gene, em pacientes esquizofrênicos, permitiu sugerir a existência de uma associação entre as alterações genéticas e moleculares com a patofisiologia desta doença comportamental.O presente projeto visa estudar melhor o papel da atividade enzimática da Ndel1 utilizando as ferramentas colecionadas até agora, como o cDNA codificante para a Ndel1 selvagem e também para o mutante pontual que não apresenta atividade enzimática, além do uso do anticorpo policlonal monoespecifico gerado em nosso laboratório e que apresenta atividade anti-catalítica. O uso destas ferramentas ira permitir a identificação de ligantes da Ndel1, tanto para a sua forma nativa como para a forma enzimaticamente inativa, através da cromatografia por afinidade. A caracterização destes ligantes permitirá a posterior análise e caracterização do efeito de cada um deles sobre a atividade enzimática da Ndel1, pois a importância das interações de macromoléculas nos processos celulares, como por exemplo nas modificações pós-traducionais e nos mecanismos de sinalização e modulação de atividade são bem reconhecidos. Este estudo permitirá ainda a possível identificação do substrato peptídico preferencial desta enzima citosólica, que até o momento ainda é desconhecido, o que tem restringido/limitado a avaliação da atividade enzimática para os substratos identificados in vitro. Além disto, estas mesmas ferramentas irão permitir ainda, estudar o efeito da super-expressão heteróloga da proteína selvagem ou mutada em células mantidas em cultura, visto que o efeito da dominância negativa determinada pela Ndel1 selvagem tem demonstrado interferir no processo de neuritogênese. Entretanto, pouco ou nada se sabe ainda sobre a importância da atividade enzimática para este processo.Considerando a importância da expressão desta proteína nas células neuronais durante o processo de desenvolvimento, prevemos ainda, a melhor caracterização do promotor da Ndel1, cujos estudos iniciais indicaram uma seqüência de 69 pares de bases como sendo uma região cis importante para a regulação transcricional da Ndel1, que parece ter a sua expressão finamente modulada ao longo do processo de maturação e migração neuronal durante a embriogênese.Em suma, este estudo pode sugerir um novo caminho para o desenho de estratégias que modulem a expressão ou a atividade desta proteína, que tem se mostrado ser de suma importância para a diferenciação neuronal, formação do sistema nervoso central e, portanto, também para a patofisiologia de varias doenças neurológicas.De fato, recentemente este projeto foi selecionado pelo edital Biominas Roche por apresentar potencial interesse como biomarcador para o diagnostico de pacientes esquizofrênicos. (AU)