Caracterização cinética e efeito de mutações na interface oligomérica da Nucleosídeo Difosfato Kinase de Leishmania major.

Resumo

A nucleosídeo difosfato kinase (NDK) é uma enzima responsável pela produção de nucleosídeos trifosfatados e está envolvida com vários processos celulares. A NDK é secretada no meio extracelular e considerada um fator de patogenicidade em patógenos intracelulares como Mycobacterium tuberculosis, Vibrio cholerae e Leishmania amazonensis. Este projeto tem por objetivo caracterizar a atividade cinética da enzima recombinante nucleosídeo difosfato kinase (NDK) de L. major por cromatografia de fase reversa e avaliar o efeito de mutações na interface oligomérica, relacionando as alterações na estrutura com a atividade catalítica da enzima e com a atividade funcional na interação com macrófagos. Os objetivos específicos do projeto são: 1) Mutagênese sítio-dirigida da NDK recombinante para análise da relevância de aminoácidos (R17A, E28A, P97S, P100G, P100S-delta5C-terminal e delta5C-terminal) no estado oligomérico e a conseqüência da alteração quaternária na atividade da enzima; 2) purificação das enzimas mutantes em resina de Ni2+ e obtenção dos parâmetros cinéticos com sistema de acoplamento enzimático piruvato kinase/lactato desidrogenase; 3) Estabelecimento da análise da reação usando cromatografia de fase reversa para obtenção dos parâmetros cinéticos dos nucleotídeos aceptores do fosfato.4) Caracterização das estruturas secundária, terciária e quaternária por de estudos de espectroscopia de dicroísmo circular, de fluorescência e por filtração em gel; 5) Análise da citotoxicidade do eATP e da invasão em macrófagos na presença de NDKrec e de mutantes para avaliar o efeito das mutações nessas duas atividades funcionais;Essa enzima já foi purificada e teve sua caracterização cinética parcial feita pelo aluno proponente desse projeto, durante sua iniciação científica. A obtenção dos parâmetros cinéticos dos doadores de fosfato será feita com sistema acoplado de enzimas (piruvato kinase - lactato desidrogenase) e para os receptores será estabelecida a cromatografia de reversão de fase em HPLC com os produtos da reação. O primeiro mutante desse grupo, K30A, já mostrou uma diminuição na atividade catalítica e está sendo iniciada a caracterização da estrutura quaternária da proteína. Ainda para interface trimérica, uma mutação sugerida é R17A, pois esta também realiza ligação de hidrogênio com o monômero vizinho (Janin et al., 2000), assim como a Lisina na posição 30. Um mutante E28A foi descrito como importante para a interface do dímero (monômero de um trímero com o do outro) e será feito para a NDK de L. major. A alça Kpn é essencial para manutençao da estrutura da proteína (Webb et al., 1995) e as mutaões P97S e P100S já foram descritas por alterar a posição da alça Kpn, desestabilizando o trímero e interferindo diretamente na oligomerização (Lascu et al., 1992). Ainda, para avaliar o envolvimento da alça C-terminal na oligomerização, esta será diminuída de 5 aminoácidos, inclusive no mutante P100G. A estrutura quaternária será analisada por filtração em gel para confirmar as alterações na oligomerização. Estudos de dicroísmo circular e da fluorescência intrínseca do triptofano serão realizados para a avaliação da estabilidade da estrutura secundária, terciária e quaternária da NDK nativa e mutantes. Com fluorescência, serão avaliadas a supressão e a anisotropia de florescência intrínseca, que fornecerão dados sobre o acesso de supressores e do movimento da estrutura, permitindo inferências sobre a oligomerização Ainda, com dicroísmo circular, será obtido o perfil de desnaturação térmica e por agentes caotrópicos, alterando as estruturas secundária, terciária e quaternária da proteína. O efeito dessas mutações na estrutura quaternária da LmNDK será avaliado com um experimento de abordagem funcional em que será investigada o papel da estrutura oligomérica da NDK na citotoxicidade e na invasão de macrófagos causada pela presença de ATP.