Estudo da função biológica da Oxidase Alternativa (AOX) de Moniliophthora perniciosa (fungo da vassoura de bruxa) em Saccharomyces cerevisiae.

Resumo

Moniliophthora perniciosa, agente etiológico da doença vassoura de bruxa do cacaueiro, disseminou-se rapidamente, provocando um colapso na economia regional baiana, correspondendo a um total de 90% de perdas na produção de cacau (Gildemberg et.al, 2010). Mesmo após a aplicação de antifúngicos baseados na inibição da cadeia principal de transporte de elétrons, M. perniciosa continua a infecção. Diversos autores propõem que a sobrevivência desse fungo se daria pela cadeia transportadora de elétrons alternativa cuja principal enzima é a oxidase alternativa (AOX). Isso porque, sabe-se que ao inibir o transporte de elétrons mitocondrial há uma alta geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). AOXp é uma oxidase terminal capaz de realizar o transporte de elétrons mitocondrial, catalisando a redução do oxigênio à água, desviando os elétrons que seriam usados na cadeia respiratória para a síntese de ATP. Assim, células que expressam AOX produziriam menos ATP, mas aliviariam o estresse oxidativo. O presente trabalho tem como objetivo testar essa hipótese. Para isso, expressaremos o gene (Mp-AOX) em Saccharomyces cerevisiae para realizarmos estudos dessa via alternativa na prevenção de estresse oxidativo, buscando compreender os mecanismos moleculares envolvidos na resistência de M. perniciosa aos fungicidas comerciais. Construiremos o vetor de expressão em leveduras com a inserção do gene AOX e realizaremos medidas da taxa de crescimento e formação de massa celular, da geração de ROS mitocondrial e quantificaremos o ATP das células de levedura expressando Mp-AOX. Realizaremos ainda, testes de viabilidade na presença de inibidores da cadeia respiratória principal Antimicina A e azoxistrobina, do inibidor específico de AOX SHAM e na presença de peróxido de hidrogênio. Isolaremos ainda, mitocôndrias que expressam AOX a fim de testar a funcionalidade dos complexos respiratórios.