Caracterização de ORFs de função desconhecida envolvidas na resposta antioxidante em Saccharomyces cerevisiae

Resumo

Aproximadamente 800 genomas foram seqüenciados e apenas 40% das seqüências obtidas são anotadas como genes de função conhecida. Saccharomyces cerevisiae é um dos organismos modelo mais bem estudado, no entanto aproximadamente 20% das ORFs ("open reading frames") possuem estrutura não determinada e função molecular desconhecida. Diante desse quadro, o presente projeto se propõe a caracterizar algumas dessas ORFs, as quais estejam envolvidas na resposta antioxidante. O projeto é relevante na área de estudos da regulação celular redox, pois investiga novas vias e mediadores para o processo. A todo instante estamos expostos às espécies reativas de oxigênio, subprodutos da respiração celular. Além disso, radiações UV, poluição e vários outros fatores ambientais promovem a formação de espécies pró-oxidantes, que em excesso, levam ao estado de estresse oxidativo. O estresse oxidativo é conhecido por resultar em danos em biomoléculas como DNA, proteínas e lipídeos. Para defender as células contra esses danos possuímos um complexo sistema antioxidante, sendo vários de seus componentes com função biológica pouco compreendida. Em poucos anos muito tem sido descoberto sobre diversas propriedades de enzimas e moléculas de baixo peso molecular como antioxidantes. A descrição da sulfirredoxina quebrou um paradigma a respeito de estados superoxidados de cisteínas protéicas, sendo um exemplo de enzima de reparo de proteínas, assim como a metionina sulfóxido redutase (descrita na década de 80). A vitamina C passou de agente neutralizante de espécies oxidantes para o status de dupla ação: atuando também na prevenção de formação dos radicais livres, já que regenera enzimas antioxidantes responsáveis por neutralizar os pró-oxidantes (como peróxidos - Monteiro et al., PNAS, 2007). Os pró-oxidantes, por sua vez, têm tido papel cada vez mais importante na compreensão da biologia celular como moléculas sinalizadoras, sendo o exemplo mais clássico o óxido nítrico. A descoberta das vias de sinalização mediadas por esse radical livre (também descritas na década de 80) levou a descoberta de novos medicamentos e significativa melhora na qualidade de vida de muitas pessoas. Esses são exemplos do quanto ainda precisamos estudar os mecanismos redox, pois importantes mediadores desse processo ainda estão sendo descobertos. Após mais de 10 anos do término do sequenciamento do genoma da Saccharomyces cerevisiae, cerca de 1200 possíveis proteínas não estão caracterizadas. Através de nossos estudos poderemos descobrir novos caminhos metabólicos, novos mediadores tão importantes quanto o óxido nítrico e quem sabe, trazer vários benefícios e conhecimento a respeito da biologia celular através de suas caracterizações. O projeto abre também a possibilidade de diversas colaborações; a coleção de leveduras separadas para esse projeto permite a análise de outros fenótipos que envolvam mecanismos básicos de biologia celular, de interesse de qualquer grupo de pesquisa. Usaremos ensaios de viabilidades com uma coleção de mutantes para as ORFs de levedura, ensaios de complementação e estudos individuais da expressão gênica para determinar a função biológica. Usaremos clonagem, expressão heteróloga e purificação das proteínas alvo para testes de atividade e estudos estruturais comparativos das mesmas com a finalidade de compreender a função molecular e bioquímica. A resposta antioxidante está relacionada com vários processos patológicos humanos como doenças neurodegenerativas, envelhecimento, câncer, processos inflamatórios, isquemia-reperfusão, dentre outros. Além disso, a compreensão do metabolismo e da fisiologia dessa levedura pode ter implicações diretas em diversas áreas biotecnológicas já que S. cerevisiae é amplamente utilizada nos processos fermentativos (produção de etanol, vinhos, cerveja, pães) e em produção heteróloga de proteínas de interesse industrial e comercial. (AU)