Estudo de SCI1 e suas interações proteína-proteína, que resultam na inibição do ciclo celular

Resumo

Em nosso laboratório, foi identificado o gene SCI1 (Stigma/style Cell cycle Inhibitor 1), capaz de controlar a proliferação celular na porção superior do pistilo (DePaoli et al., 2011), provavelmente por inibir o complexo ciclina-CDK (Cyclin Dependent protein Kinase). Para exercer sua função, a proteína SCI1 precisa interagir com outras proteínas. Em projeto anterior (processo no. 10/50213-2), foram identificadas algumas proteínas candidatas a interação, como a CDKG;2 e duas proteínas da família 14-3-3. Assim, os objetivos deste projeto são: 1) Identificar/confirmar a(s) ciclina(s) que interage(m) com SCI1; 2) Identificar parceiros/substratos da quinase dependente de ciclina (CDKG;2), por °screening"da biblioteca de estigmas/estiletes em vetor de duplo-híbrido; 3) Estudar a hipótese de SCI1 regular a divisão celular, por meio da inibição da CDKG;2. a. Testar a interação por duplo híbrido e/ou BiFC ("Bimolecular Fluorescence Complementation") das proteínas cyclin L e outras ciclinas (cyclin B1 ou cycBn-related) com a CDKG;2; b. Caso alguma ciclina de interação com CDKG;2 seja identificada nos experimentos direcionados (item 3.a) ou no "screening", testar a atividade de CDKG;2 sobre histonas e/ou outro possível substrato identificado no "screening"; c. Se a e b forem positivos, testar a inibição da atividade da CDKG;2 por SCI1; 4) Testar a hipótese de tecido-especificidade na expressão de parceiros de interação de SCI1; 5) Analisar a localização subcelular das proteínas CDKG;2,14-3-3A e 14-3-3D; 6) Realizar experimentos de duplo-híbrido e/ou BiFC para testar a formação de homo e hetero dímeros das 2 proteínas da família 14-3-3 e suas possíveis interações com SCI1; 7) Caracterizar a fosforilação da proteína SCH, pela comparação dos resíduos fosforilados de SCI1 extraída de folhas e pislilos de plantas transgênicas 35Sprom::SCI1-GFP; 8) Confirmar a interação de SCH com novos candidatos de interação, identificados por "pull-down" ou o "screening" de duplo híbrido. (AU)