Estudos biofísicos e estruturais da hemoglobina extracelular de Glossoscolex paulistus, e das suas subunidades monômero d e dodecâmero (abcd)3.

Resumo

A hemoglobina de Glossoscolex paulistus (HbGp) tem uma massa molecular de 3,6 MDa determinada por ultracentrifugação analítica. A HbGp apresenta alta estabilidade oligomérica, resistência a auto-oxidação, e alta afinidade em ligar oxigênio. A estrutura quaternária desta macromolécula apresenta 144 cadeias com grupo heme (globinas) e 36 cadeias sem grupo heme (linkers), dispostos em duas camadas hexagonais. Esta classe de proteínas apresenta um potencial promissor em aplicações biomédicas como, por exemplo, como substituto sanguíneo. Neste sentido, as hemoglobinas de anelídeos são objeto de estudos em vários grupos de pesquisas no mundo. Estudos de ultracentrifugação analítica mostraram que a HbGp dissocia-se em pH alcalino, na presença de surfactantes e de ureia, originando subunidades menores, tais como o dodecâmero, tetrâmero, trímero e monômero d. Estudos recentes mostram que a interação HbGp-surfactante induz vários processos conformacionais, tais como, agregação, dissociação oligomérica e desnaturação. Por outro lado, a estabilidade oligomérica está fortemente relacionada com o estado de oxidação do ferro e com o ligante coordenado no centro metálico. Assim, o presente projeto de pós-doutorado propõe estudar os processos cinéticos e termodinâmicos de dissociação e desnaturação de HbGp na presença da ureia e do cloridrato de guanidina. Adicionalmente, estudos sobre o desenovelamento térmico de HbGp na presença de pequenas concentrações de ureia e de cloridrato de guanidina serão realizados por várias técnicas espectroscópicas e hidrodinâmicas com o objetivo de aprofundar o conhecimento sobre os mecanismos de desnaturação desta proteína na presença destes agentes, bem como sobre a estequiometria das subunidades no oligômero, e da estabilidade da proteína nativa em diferentes condições. Esse estudo comparativo do efeito de dois agentes desnaturantes com características físico-químicas diferentes, um neutro (ureia) e outro carregado (catiônico, cloridrato de guanidina) irá possibilitar a avaliação da contribuição da interação eletrostática no sistema proteína-desnaturante. Além disso, no intuito de compreender melhor a interação proteína-surfactante, este projeto propõe caracterizar os principais sítios de ligação do SDS e CTAC na subunidade monomérica d, através de técnicas de cristalização e modelagem molecular por homologia. Os ensaios de modelagem molecular com o tetrâmero abcd, o trímero abc, o monômero d e o dodecâmero (abcd)3 serão desenvolvidos, a fim de caracterizar tanto as interações entre os surfactantes e estas subunidades, quanto os contatos entre as subunidades na estrutura oligomérica da HbGp. Estes estudos serão realizados em concentrações sub-milimolares de surfactantes, adequadas para avaliar a associação dos mesmos à proteína sem promover uma desnaturação extensa. Para alcançar estes objetivos propõe-se o uso de técnicas de cristalização e modelagem molecular por homologia, bem como, espectroscópicas e hidrodinâmicas, tais como a absorção óptica, o dicroísmo circular, DLS, RPE e ultracentrifugação analítica.