Efeito da crotoxina sobre a ação moduladora dos macrófagos sobre eventos da neovascularização: ensaios in vitro

Resumo

Dados da Literatura têm demonstrado que a crotoxina (CTX), toxina majoritária do veneno de serpente Crotalus durissus terrificus apresenta ação supressora sobre a resposta imune e sobre o crescimento tumoral, além de acarretar inibição dos eventos da resposta inflamatória, modulando, em particular a funcionalidade de macrófagos, células fundamentais para os mecanismos da defesa inata. Estudos realizados pelo nosso grupo demonstraram que a CTX estimula a capacidade secretória de macrófagos peritoneais de ratos obtidos de animais portadores de tumor de Walker 256 no flanco superior. Esse aumento é acompanhado por significativa diminuição da massa tumoral. Adicionalmente, ensaios in vitro, demonstraram que macrófagos previamente tratados com CTX inibem a proliferação de células tumorais, em modelo de co-cultura, mediada, em parte, pelo aumento da produção de reativos do oxigênio e nitrogênio, secreção de IL-1² e a geração da LXA4 e 15-epi-LXA4. De fato, a literatura vem mostrando a importância dos macrófagos, tanto na gênese tumoral, como no seu desenvolvimento, apresentando ação dual, uma vez que desempenham atividades que podem prevenir ou favorecer a progressão tumoral. Além da ação sobre a proliferação de células tumorais, os macrófagos também influenciam em outros eventos do processo tumoral, como por exemplo, a neovascularização. Uma vez que foi demonstrado que a CTX modula a funcionalidade de macrófagos, o objetivo geral deste trabalho é investigar se a atividade secretória de macrófagos tratados com CTX interfere nos eventos-chave da neovascularização, tais como a adesão, migração e proliferação de células endoteliais. Para tanto, utilizando modelo de angiogênese in vitro, sobrenadantes de macrófagos tratados com CTX ou sobrenadantes de co-cultura entre macrófagos tratados previamente com a toxina e células tumorais da linhagem LLC WRC 256 serão adicionados à cultura de células endoteliais tímicas (t.End.1) e serão avaliados os seguintes parâmetros: 1) comportamento de adesão da célula endotelial aos seus ligantes naturais, tais como colágeno I e fibronectina, utilizando ensaio de competição; 2) a capacidade proliferativa das células endoteliais; 3) a migração da célula t.End.1 em matriz extracelular, utilizando os métodos de Wound healing e transwell; 4) a formação de vasos induzidos em matrigel, no modelo 3D; 5) a liberação de VEGF e MMP-2 e MMP-9, por meio de ensaio imunoenzimático (EIA). (AU)