Estudos do papel da fosforilação e da ligação de proteínas parceiras na regulação da função de miosinas V humanas

Resumo

Neste próximo projeto continuaremos nossos estudos, como anteriormente, nas MioVs. A combinação de abordagens estruturais e funcionais será mantida e nosso objetivo consistirá em responder novas perguntas que surgiram ao longo desses dois anos de trabalho.Primeiramente, queremos saber qual o papel da fosforilação do CBD na regulação da função de MioV de mamíferos. Para tanto, pretendemos resolver a estrutura da forma fosfo-mimética do CBD de MioVa, investigar se a fosforilação interfere no mecanismo de auto-inibição desse motor molecular e testar se ela determina a seletividade de proteínas parceiras.Nossa segunda pergunta é sobre o papel do splicing alternativo no reconhecimento e seletividade de parceiros moleculares para MioV. Nesse caso, realizaremos ensaios de duplo híbrido usando como iscas construções que contenham o CBD de MioVa fusionados a diferentes combinações de exons do domínio coiled coil. Paralelamente, realizaremos o mesmo ensaio usando como isca construções de MioVb e MioVc similares as construídas para MioVa, a fim de se obter informações a respeito de redundância e divergência funcional entre essas três proteínas parálogas. Para melhor entender os determinantes estruturais para o reconhecimento de proteínas parceiras por MioVs, pretendemos estudar complexos entre as proteínas Rab (Ras-like small GTPases) 3a, 8a, 10 e 39b e domínios de MioV por cristalografia, SAXS e outras técnicas que se fizerem necessárias. Tais interações foram recentemente identificadas por Lindsay e colaboradores (Lindsay, et al. 2013). Interessantemente, Rab3a e 39b interagem com o CBD de MioVa enquanto que Rab 8a e Rab10 se ligam em regiões específicas do domínio coiled coil que sofrem splicing alternativo (Lindsay, et al. 2013). Esse conjunto de informações terá uma grande contribuição para o entendimento de aspectos estruturais e funcionais das miosinas de classe V. (AU)