Redes estruturais e propriedades funcionais em enzimas

Resumo

Na literatura há evidências indicando que propriedades funcionais de enzimas podem ser determinadas por conjuntos de resíduos de aminoácidos, ao menos parcialmente independentes, que formam cadeias através de contatos covalentes e não-covalentes. Este projeto tem por objetivo geral o delineamento destes "conjuntos de resíduos" em enzimas e caracterização experimental de sua participação na determinação de propriedades funcionais como atividade catalítica, especificidade pelo substrato e estabilidade térmica. beta-glicosidases da família GH1 e uma lisozima da família GH23 serão usadas como modelos experimentais. O delineamento dos "conjuntos de resíduos" potencialmente relacionados com propriedades funcionais destas proteínas será feito por meio da representação da estrutura proteica como redes (grafos). Já as propriedades funcionais serão avaliadas através de parâmetros cinéticos para hidrólise de diferentes substratos (kcat e Km), constantes de velocidade do processo de inativação térmica (kinat) e temperatura de transição (Tm) de desnaturação térmica. Na linha de trabalho 1 a estrutura cristalográfica da beta-glicosidase Sfbgli será determinada pelo método de substituição molecular a partir de dados de difração de raios-X. Em seguida a estrutura desta beta-glicosidase será analisada como uma rede buscando identificar seus nós (resíduos) centrais ("hubs"). Experimentos de mutação sítio-dirigida serão empregados para substituir por alaninas os resíduos centrais da beta-glicosidase Sfbgli e através da caracterização destas enzimas mutantes buscará se estabelecer qual a relação entre os resíduos centrais e atividade catalítica, especificidade pelo substrato e estabilidade térmica. Adicionalmente mutações serão dirigidas para vizinhos de um resíduo central da beta-glicosidase Sfbgli e a caracterização da estabilidade térmica e atividade catalítica destes mutantes buscará evidenciar se os resíduos centrais mediam a propagação de efeitos mutacionais nestas enzimas.Finalmente para estabelecer correlação entre os resíduos centrais e a propagação de movimento através da estrutura proteica, a lisozima MdL1 terá sua dinâmica avaliada através de espectros de NMR, sendo calculados parâmetros de ordem para cada um dos seus resíduos na enzima nativa e em mutantes com substituição de resíduos centrais. Deste modo, será possível avaliar diretamente se a retirada de resíduos centrais de uma rede estrutural proteica altera a propagação de movimento através da proteína.A linha de trabalho 2 buscará entender como os dois potenciais subdomínios (b/a)4 que compõem a estrutura em (b/a)8 barril das beta-glicosidases combinam-se gerando as propriedades funcionais destas enzimas. Para tal, com o objetivo de avaliar as propriedades individuais destes dois subdomínios em uma beta-glicosidase modelo, as metades N- e C- terminal da beta-glicosidase Sfbgli serão produzidas isoladamente e caracterizadas quanto a sua estrutura e atividade enzimática. Como parâmetros estruturais serão usados espectros de dicroísmo circular, fluorescência de triptofanos, espalhamento de luz dinâmico (DLS) e espalhamento de raios-X de baixo ângulo (SAXS).Além disso, também na linha 2, as beta-glicosidases de Thermatoga maritima, Paenebacillus polymyxa e quimeras combinando as metades N- e C- terminal destas enzimas serão caracterizadas quanto as suas constantes de velocidade e temperaturas de transição (Tm) de inativação térmica, buscando entender como as estabilidades térmicas de cada uma das metades (subdomínios) se combinam gerando a estabilidade destas beta-glicosidases nativas.Portanto, com base no acima exposto, este projeto se apresenta como um estudo das bases da relação estrutura-atividade em enzimas. (AU)