Fotossensibilização em membranas miméticas lisossomais para investigação do mecanismo de morte celular associada a autofagia.

Resumo

Gerar espécies reativas de oxigênio (ROS) em alvos intracelulares específicos é a melhor estratégia para maximizar a eficiência da terapia fotodinâmica (PDT), uma vez que o tempo de vida curto e a rápida reatividade são fatores limitantes na distribuição de ROS dentro das células. Durante anos a literatura indicou a mitocôndria como organela-alvo para PDT, entretanto trabalhos mais atuais indicam o lisossomo como organela-chave para o aumento da eficiência na PDT. Fotossensibilizadores (FS) que danificam lisossomos dificultam a função autofágica pró-sobrevivência resultando em morte celular associada à autofagia e aumentam a eficiência na PDT mesmo quando o FS tem menor interação com a membrana (T.M. Tsubone, tese de doutoramento 2016). Tal fato quebra alguns paradigmas aceitos na literatura de que (i) a ligação em membrana está diretamente relacionada à fototoxicidade em células, (ii) a mitocôndria é uma a organela-chave em termos de especificidade para PDT e (iii) a apoptose é o mecanismo de morte celular mais indicado em termos de melhor eficiência para PDT. Portanto, já que o foto-dano em lisossomos tem potencial para contrapor tais paradigmas nesta área, temos como objetivo desvendar o papel do lisossomo no mecanismo de morte celular associada à autofagia. Neste sentido, este projeto terá como base a investigação dos efeitos da fotosensibilização em bicamadas lipídicas representando membranas lisossomais, sendo estas mimetizadas por vesículas unilamelares gigantes (GUVs) de maneira inédita na literatura.Uma vez que a abertura de poros causada pela fotossensibilização permite o vazamento, para o citosol, de enzimas e/ou macromoléculas relacionadas a um mecanismo de morte celular específico (apoptose e/ou autofagia), pretendemos avaliar o aumento de permeabilidade da membrana lisossomal via determinação de tamanho de poros. Além de estimar a dimensão do poro formado pela fotossensibilização em GUV, também investigaremos a formação de domínios de membrana consequentes da foto-oxidação e sua relação com a via lisossomal-autofágica como sequência da PDT.Para isso, nos nossos sistemas utilizaremos dois fotossensibilizadores que tendem a se localizar em lisossomos: TPPS2a (porfirina) e DMMB (fenotiazínico) em dois modelos de membrana: i) GUVs constituídas apenas por fosfolipídeo insaturado (sistema mimético simples e bem conhecido) e ii) GUVs que mimetizem membranas de lisossomos (sistema mimético intracelular, inédito na literatura). Tanto o tamanho do poro quanto os domínios gerados pela fotossensibilização serão investigados sob técnicas de microscopia ótica de fluorescência e microscopia de força atômica.