Identificação das proteínas-alvo dos pirofosfatos de inositol PP-IP4 e IP7 em Leishmania braziliensis

Resumo

Em eucariotos modelo, pirofosfatos de inositol (PP-IPs) - principalmente PP-IP4, IP7 e IP8 - estão envolvidos em uma ampla gama de processos celulares, como regulação do comprimento dos telômeros e recombinação homóloga (HR). No entanto, as proteínas-alvo dos PP-IPs, assim como seu mecanismo de ação, ainda não estão bem estabelecidas. PP-IP4, IP7 e IP8 são sintetizados através de vias complementares que envolvem a participação das quinases IP6K e PP-IP5K. Tripanossomatídeos possuem um gene ortólogo para IP6K, mas aparentemente não possuem ortólogos para PP-IP5K, i.e., não sintetizam IP8, o que os torna excelentes modelos para o estudo de PP-IP4 e IP7. Assim, este projeto de Mestrado consiste em amplificar, clonar, expressar e purificar a quinase IP6K recombinante de L. braziliensis, a fim de usá-la para sintetizar in vitro PP-IP4- e IP7-marcados e, em seguida, usá-los para rastrear suas proteínas-alvo. Resumidamente, IP6K recombinante será usada para gerar PP-IP4 e IP7 a partir de, respectivamente, I(3,4,5,6)P5 e IP6 isolados de L. braziliensis e um kit comercial contendo ATP marcado (³-[(Propargil)-imido]-ATP). Como controle, usando a mesma abordagem, IP5K recombinante será gerada e usada para sintetizar IP6 (que não é um pirofosfato) a partir de I(3,4,5,6)P5, usando o mesmo kit comercial contendo y-[(propargil)-imido]-ATP. Após a obtenção dessas moléculas, os extratos de L. braziliensis serão utilizados para realizar reações de pirofosforilação in vitro, nos quais se espera que haja apenas a hidrólise da porção pirofosfato de PP-IP4 e IP7 e transferência não enzimática dos grupos ²-fosfato para as proteínas-alvo. Em seguida, as proteínas-alvo pirofosforadas serão capazes de reagir com azida acoplada à biotina, permitindo sua captura por pull-down usando esferas de estreptavidina. As proteínas capturadas serão identificadas por espectrometria de massas (LC-MS/MS). Vale ressaltar que essa abordagem será de fundamental importância para responder às questões essenciais levantadas pelo projeto principal. (AU)