Marcação dos genes META1 e META2 em Leishmania major utilizando CRISPR-CAS9, como forma de identificar formas metacíclicas em cultura axênica

Resumo

As leishmanioses são doenças negligenciadas causadas por parasitos do gênero Leishmania, para a qual não há tratamento nem controle adequados. Os tratamentos disponíveis atualmente apresentam elevado grau de toxicidade, além de serem caros e induzirem à seleção de parasitos resistentes. Isso evidencia a necessidade de se buscar novos alvos terapêuticos, por isso, é necessário compreender melhor o ciclo de vida do parasito e suas fases, tais como o processo de metaciclogênese. É durante esta fase que se dá a diferenciação morfológica e funcional do protozoário, que passa da forma promastigota procíclica não infectante, para a forma promastigota metacíclica que é altamente infectante para o hospedeiro mamífero. Durante esse processo há a expressão diferenciada de vários genes, alguns dos quais codificam fatores de virulência. Dentre esses, há os genes META1 e META2 que se encontram em todas as espécies já analisadas do parasito. Neste projeto propomos a identificação de parasitos na fase de metaciclogenese pela expressão em fusão das proteínas codificadas por META1 e META2 com proteínas fluorescentes. A marcação endógena desses genes em Leishmania major será realizada utilizando-se o sistema CRISPR-Cas9. Para avaliar se as proteínas em fusão só serão expressas na forma metacíclica e se a fusão não altera a metaciclogenese e o perfil de crescimento do parasito, utilizaremos diferentes ensaios. Desta forma, este trabalho poderá gerar linhagens celulares que se tornarão ferramentas importantes para as pesquisas que estamos realizando com a maquinaria telomérica durante o ciclo de desenvolvimento do parasito e que visam identificar fenômenos biológicos e moleculares e que são exclusivos de parasitos na forma metacíclica.