Geração de linhagens de T. cruzi (cepa CL Brener) nocautes (KO) para IP6K e avaliação da capacidade de reparo por recombinação homóloga (HR)

Resumo

Em eucariotos modelo, pirofosfatos de inositol (PP-IPs) - principalmente PP-IP4, IP7 e IP8 - estão envolvidos em uma ampla gama de processos celulares, como regulação do comprimento dos telômeros e recombinação homóloga (HR). No entanto, o mecanismo de ação dos PP-IPs nas vias relacionadas ao metabolismo do DNA (sobretudo na via de reparo por recombinação homóloga - HR) não é totalmente compreendido. PP-IP4, IP7 e IP8 são sintetizados através de vias complementares que envolvem a participação das quinases IP6K e PP-IP5K. Tripanossomatídeos possuem um gene ortólogo para IP6K, mas aparentemente não possuem ortólogos para PP-IP5K, i.e., não sintetizam IP8, o que os torna excelentes modelos para o estudo de PP-IP4 e IP7. Assim, este plano de pesquisa de mestrado consiste em gerar linhagens de T. cruzi (cepa CL Brener) KO para IP6K utilizando o sistema CRISPR/Cas9, desafiar a linhagem gerada com radiação ionizante (IR) e avaliar a capacidade de reparo por HR comparativamente à linhagem WT utilizando citometria de fluxo, curvas de crescimento e cinética de recrutamento proteico (western blot - WB e imunofluorescência - IFA). Resumidamente, a análise do conteúdo de DNA por citometria de fluxo será feita para identificar possíveis paradas do ciclo celular e para medir o período requerido para superá-la. As curvas de crescimento serão realizadas para observar o padrão de proliferação após IR, e a cinética de recrutamento comparativa poderá identificar diferenças sutis no padrão de recrutamento de componentes chaves da via de HR. Vale ressaltar que essa abordagem será de fundamental importância para responder às questões essenciais levantadas pelo projeto principal. (AU)