Cromatina de Trypanosoma cruzi: um caráter ativo ou dormente na transcrição de genes repórteres?

Resumo

Em tripanossomas, é geralmente aceito que a expressão gênica é principalmente regulada por mecanismos pós-transcricionais devido à falta de regiões promotoras clássicas de RNA Pol II e transcrição policistrônica. No entanto, experimentos anteriores de nuclear run-on indicam que os genes satélites têm expressão mais baixa, sugerindo algum nível de regulação (Elias, Marques-Porto et al. 2001), e uma diminuição significativa na transcrição global é observada nas formas replicativas quando comparada com as formas não replicativas (ou seja, metacíclicos) (Ferreira, Dossin Fde et al. 2008). Além disso, foi observado em Leishmania (um organismo da ordem dos tripanossomatídeos) que genes associados ao ciclo celular podem ser regulados em nível de transcrição (Chandra, Yadav et al. 2017). Assim, aqui queremos investigar se o meio genômico (ou seja, o conteúdo da cromatina) interfere na expressão de um gene repórter posicionado em partes distintas do genoma do T. cruzi. Para avaliar isso, inseriremos genes repórter de luciferase (contendo UTR 5 'e 3' adequada) usando o sistema CRISPR/Cas9, em partes distintas do genoma de T.cruzi (a saber, I. TTS e TSS putativos, II. Telomérico regiões, III. família DGF-1; IV. regiões promotoras SL; V. regiões de transcritos de RNA Pol I e Pol III; VI. Início, meio e fim de uma região policistrônica selecionada). Esses experimentos irão refletir se o empacotamento da cromatina (assim como as histonas PTMs e outras proteínas associadas à cromatina) podem influenciar a repressão/ativação em uma posição dependente do gene. Prevemos que diferenças serão obtidas entre clones cuja luciferase foi inserida em diferentes loci, portanto, para aumentar a abrangência desta regulação, avaliaremos o conteúdo de cromatina dessas regiões usando a tecnologia CLASP (ou enChIP). (AU)