Dinâmica da replicação de DNA em Trypanosoma cruzi:consequências do estresse replicativo

Resumo

O Trypanosoma cruzi é o agente etiógico da Doença de Chagas, também conhecida por Tripanossomíase americana. Esta doença é transmitida principalmente por via vetorial e estima-se que de 6 a 7 milhões de pessoas ao redor do mundo, em sua maioria na América Latina, estejam infectadas com parasita. Apesar de todo esforço de pesquisa na área da doença de Chagas, e grande conhecimento adquirido, ainda não existe uma vacina e nem um tratamento que reduza os danos provocados pelo T. cruzi no organismo humano. Assim, a compreensão da biologia do parasita abre portas para novas terapias. Neste contexto, o nosso grupo de pesquisa vêm buscando compreender a replicação do DNA em tripanosomas assim com as consequências do estresse replicativo. Este projeto visa investigar como o T. cruzi responde ao estresse replicativo para poder verificar se esta resposta está relacionada com a plasticidade genética apresentada por este parasita. Mais especificamente, verificaremos a presença de potenciais origens dormentes, a capacidade do T. cruzi ativar origens dormentes frente ao estresse replicativo, e a geração de mutações em situações de conflito entre as maquinarias de transcrição-replicação, quando esses conflitos são co-direcionais ou frontais. A identificação das origens licenciadas no genoma será realizada por meio do ensaio de Chip-seq através da precipitação da proteína Orc1Cdc6. Através de modelagens matemáticas que considerem a localização das origens ativadas e o tamanho dos cromossomos, inferiremos regiões do cromossomo com maior probabilidade de disparo de origens dormentes. Posteriormente, validaremos experimentalmente em células, induzidas a estresse replicativo com hidroxiureia, por ensaio de RT-PCR essas predições de origens dormentes ativadas pós-estresse. Além disso, induziremos uma origem de replicação em um ponto conhecido do genoma buscando verificar a geração de mutações em situações de conflito entre as maquinarias de transcrição-replicação. Para tanto, usaremos a proteína Orc1Cdc6 será fundida a proteína dead Cas9, que reconhece uma sequência no genoma, porém não consegue clivar o DNA. Em seguida, levaremos o complexo ORC a um ponto específico do genoma e verificaremos, por nanosequenciamento de DNA marcado com brdU se esta região tornou-se uma origem ativa. Após a montagem deste sistema de origem conhecida, a cultura será então mantida por diferentes tempos, e então, o policistron contendo genes que colidiram de maneira frontal (CF) e co-direcional (CC) será sequenciado para verificação de mutações.