Estudos Estruturais e Bioquímicos da Enzima ThiL na Biossíntese de Vitamina B1 em Patógenos Gram-negativos e Mycobacterium tuberculosis.

Resumo

A resistência a antibióticos é um problema global e urgente. A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que até 2050, atingiremos 10 milhões de mortes anualmente em decorrência direta de infecções causadas por organismos resistentes a antibióticos. O problema é agravado pelo número limitado de vias/alvos sobre os quais agem os antibióticos atualmente disponíveis. De acordo com Walsh e Wencevicz, os antibióticos atualmente existentes são restritos a apenas cinco alvos/vias de ação. Desta forma, somam-se (i) a difusão de cepas resistentes, (ii) o número decrescente de novos antibióticos ou de moléculas inovadoras, e (iii) o número reduzido de alvos sobre os quais os antibióticos agem. Recentemente, a enzima tiamina fosfato quinase (ThiL) foi validada como um novo alvo para o desenvolvimento de antibióticos contra Pseudomonas aeruginosa. Esta enzima faz parte da via de síntese de tiamina (vitamina B1) presente em muitos microrganismos e em plantas, mas ausente em mamíferos. Mostrou-se recentemente que a deleção (ou inibição) da enzima ThiL causa defeitos de crescimento em P. aeruginosa e reduz a virulência da bactéria. Contudo, os resultados ainda são limitados aos estudos neste organismo. Como os grupos de pesquisa dos profs. Alessandro S. Nascimento (IFSC/USP) e Carsten Wrenger (ICB/USP) vêm se dedicando aos estudos estruturais e bioquímicos das enzimas da via de síntese de tiamina, neste projeto propomos um estudo da relação estrutura-função sobre a enzima ThiL em outros organismos importantes do ponto de vista clínico, incluindo Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli e Mycobacterium tuberculosis. No escopo deste projeto, propomos a determinação da estrutura das enzimas destes organismos e a triagem de potenciais inibidores que permitam uma avaliação mais completa do papel da enzima do ponto de vista bioquímico e do ponto de vista funcional, i.e., em cultura de células. Para esta finalidade, os genes para as enzimas ThiL de K. pneumoniae, E. coli e M. tuberculosis foram sintetizados com otimização de códons para a expressão bacteriana. Testes preliminares de expressão indicam que as duas primeiras proteínas são bem expressas em E. coli e são purificadas na fração solúvel. Neste projeto pretendemos avançar com a determinação da estrutura e, aproveitando a experiência prévia do grupo e a informação estrutural, triar potenciais ligantes desta enzima que possam vir a ser inibidores para testes bioquímicos posteriores, bem como em culturas celulares. O objetivo final do projeto é a validação da inibição química desta enzima in vitro a partir de modelos estruturais experimentais. (AU)