Identificação de proteínas de superfície celular suscetíveis à oxidação de tiol em células endoteliais usando uma abordagem proteômica redox em diferentes contextos biológicos

Resumo

Demonstramos que a oxidação do ácido úrico ocorre nos estágios iniciais da aterosclerose e pode estar associada ao dano vascular e à progressão da doença. A oxidação do ácido úrico por peroxidases gera o radical livre de urato e o hidroperóxido de urato (HOOU). Também demonstramos que o HOOU oxida a PDI (proteína dissulfeto isomerase) na superfície extracelular de células endoteliais (HUVECs) e prejudica a adesão das células. É possível que o HOOU oxide outras proteínas tiólicas de superfície celular, seja diretamente ou indiretamente, por meio da troca de dissulfeto. Para identificar quais proteínas estão sendo oxidadas e interferindo na adesão celular, um estudo global de proteômica redox de superfície extracelular foi desenvolvido durante projeto de pós-doutorado, também vinculado a esse projeto JP-2. Realizamos os experimentos com 200 ¼M de HOOU e não obtivemos resultados expressivos. Acreditamos que esses resultados possam ser devido à baixa proporção do oxidante em relação ao número de células. Outros fatores a serem considerados seriam o tipo de célula utilizado, isto é, imortalizada, e a condição das células durante o experimento, ou seja, em suspensão, o que pode ser um ponto divergente, uma vez que HUVECs são aderentes. Como alternativa, optamos por testar HUVECs primárias, que parecem apresentar vantagem sobre células imortalizadas, no sentido de apresentarem melhores características adesivas e representarem melhor o contexto fisiológico. Testes iniciais para avaliar o estado redox das proteínas da superfície celular de HUVECs primárias aderidas foram realizados e mostraram que após a adesão há um perfil de proteínas mais oxidado do que reduzido, não apresentando quantidade significante de proteínas tiólicas preservadas. Dessa forma, não seria viável avaliar o efeito oxidativo do HOOU, e uma melhor condição deverá ser mais investigada. No entanto, decidimos dar um passo atrás porque não sabemos muito sobre os impactos gerais do HOOU nas células. Assim, esta bolsa TT-5 está sendo solicitada para dar continuidade a este trabalho, com o primeiro objetivo de verificar o possível efeito desse oxidante na expressão global de proteínas em HUVECs. O grupo obteve resultados interessantes em relação à expressão proteica alterada após tratamento com ácido úrico em HUVECs, e acreditamos que estudar o HOOU neste sentido complementará esses achados e também ajudará a compreender melhor o papel do ácido úrico na remodelação vascular e nas doenças cardiovasculares. Redox switches em proteínas de superfície celular durante diferentes tempos do processo de adesão celular foi outro ponto relevante também abordado no projeto de pós-doutorado. A adesão celular é essencial para a sobrevivência celular, formação de órgãos, migração celular e interação com células-alvo e a matriz extracelular, estando envolvida em muitas condições fisiológicas e patológicas. A regulação redox do processo de adesão já foi evidenciada; no entanto, este tópico tem sido pouco estudado, e o número de proteínas de superfície extracelular reconhecidas como alvo de modificação redox é limitado. Como já padronizamos essa metodologia anteriormente, e uma vez que não há um estudo global de proteínas de superfície extracelular suscetíveis a trocas tiol-dissulfeto durante o processo de adesão celular, também usamos essa metodologia para avaliar redox switches nessas proteínas em diferentes tempos (0, 1,5, 3,5 e 24 horas) de adesão celular por proteômica redox. Obtivemos resultados iniciais interessantes que mostram que esse processo pode ser dinâmico, e possivelmente há proteínas que são mais oxidadas ou reduzidas ao longo da adesão, conforme avaliado por Western Blot. Agora, como segundo objetivo dessa bolsa TT-5, será realizado o estudo proteômico dessas amostras, o que caracterizará melhor a dinâmica do processo oxidativo dessas proteínas durante a adesão celular, proporcionando uma compreensão mais aprofundada da sinalização redox extracelular.