Hiperplasia congênita da adrenal: mutações novas e suas alterações na atividade enzimática

Resumo

O laboratório de Genética Molecular Humana do Centro do CBMEG-UNICAMP em colaboração com o grupo de Endocrinologia Pediátrica do Departamento de Pediatria da FCM e também com o Departamento de Endocrinologia da FMRP-USP, vêm desenvolvendo um trabalho de identificação e caracterização de mutações nos genes das CYP21A2 e CYP11B1 nas diferentes formas de Hiperplasia Congênita da Adrenal. Os alelos afetados de CYP21A2 foram caracterizados quanto à deleção, conversão gênica e 9 mutações pontuais (microconversões), eventos mutacionais bastante frequentes para esse gene. Dez mutações novas foram identificadas. Uma mutação frameshift no éxon 1, causando um códon de terminação de síntese protéica na posição 78, foi encontrada em homozigose em uma criança, filha de casal consanguíneo; uma mutação frameshift no éxon 4, em heterozigose, gerando um códon de terminação de síntese protéica no resíduo 294 e, uma nonsense que cria um códon de parada de síntese protéica no exon 10. Dada a gravidade dessas mutações, não será necessário testar a atividade das enzimas resultantes. Já para as outras sete variações nucleotídicas há necessidade de comprovação do grau de alteração produzido na atividade enzimática para uma descrição adequada da mutação. Serão objeto deste estudo cinco mutações missense e, duas trocas de nucleotídeo que altera o sítio doador e receptor de splice normal no íntron 2, respectivamente. A primeira, de origem materna, foi encontrada em uma paciente que já apresentava a mutação V281L no alelo materno, que causa a forma não-clássica da doença. No entanto, a paciente apresenta a forma clássica perdedora de sal, portanto seu primeiro genótipo não condizia com o fenótipo. A segunda foi encontrada tanto em homozigose quanto em heterozigose em oito pacientes não relacionados. Além das mutações de splicing já citadas, pretende-se avaliar uma alteração nucleotídica no íntron 7 quanto à possibilidade de alteração no processo de splicing uma paciente cujo fenótipo não condiz com o genótipo encontrado. No rastreamento de mutações no gene CYP11B1 em indivíduos portadores de deficiência da 11beta-OH, foram encontradas três mutações das quais duas ainda não descritas (uma inserção e uma mutação missense). A mutação missense (G267S), encontrada em homozigose, em uma paciente filha de casal consangüíneo, origina-se de uma troca G>A no último nucleotídeo do éxon 4, primeira base do códon 267. O interessante desta mutação é que o códon alterado forma-se pelo último nucleotídeo do éxon 4 e pelos dois primeiros nucleotídeos do éxon 5. Portanto, suspeita-se que esta mutação seja deletéria por afetar também a atividade do sítio doador de splice do íntron 4. Nesse caso, há a necessidade de se avaliar não só a atividade da enzima resultante, como também estudar as possíveis alterações no processo de splicing.Desta forma, o presente projeto tem por objetivo clonar e expressar os genes CYP21 e CYP11B1 e avaliar tanto a formação de transcritos quanto às atividades da enzima 21-hidroxilase e 11 beta-OH nas suas formas normais e mutantes. Bem como, estudar através da técnica de mini-genes as possíveis alterações no processo de splicing em variantes gênicas. É nosso objetivo também dar continuidade ao rastreamento de novas mutações tanto no gene CYP21 como no gene CYP11B1. Sendo assim, uma vez encontradas mutações novas, estas serão incorporadas ao estudo da atividade enzimática. De uma forma geral, este trabalho é de grande importância e relevância para o laboratório de Genética Molecular Humana do CBMEG já que possibilitará a capacitação técnica do laboratório com a introdução novas metodologias as quais serão de extrema utilidade para a investigação do efeito biológico de mutações. Além disso, o trabalho resultará na formação de profissionais especializados. Trata-se de um trabalho inédito uma vez que não existe no Brasil nenhum grupo que estude a atividade de enzimas mutantes para os genes CYP21 e CYP11B1. (AU)