Estudo do papel fisiológico da proteína Nek7, no ciclo celular e na tumorigênese

Resumo

As Neks são proteínas quinases similares a NIMA, proteína que é indispensável para que aconteça mitose em leveduras. Em mamíferos, existem 11 Neks e dessas apenas Nek2, Nek6, Nek7, e Nek9 tem sido diretamente implicada na regulação mitótica. Recentes estudos apóiam a idéia de que Nek6, Nek7, e Nek9 agem em conjunto numa mesma cascata de sinalização na mitose e de que Nek6 e Nek7 possuam um papel independente na formação do fuso mitótico e na citocinese. Entretanto, pouco se sabe acerca do mecanismo pelo qual Nek6, Nek7 e Nek9 podem contribuir para diferentes eventos na progressão mitótica bem como sobre as diferentes funções exercidas pelas Nek6 e Nek7 na célula. Além disso, os parceiros de interação com a Nek7 humana, seus substratos, e os diferentes processos celulares ao qual está envolvida, permanecem desconhecidos. Estudos recentes mostram o envolvimento da proteína Nek7 nos mecanismos de duplicação do centrossomo, além de que Nek7 encontra-se superexpressa em cânceres de mama, colo-retal, laringe, pulmão e linfoma não-Hodgkin . Desta forma, o emprego de estudos funcionais, celulares e fisiológicos visando dissecar o caminho de sinalização da Nek7 na regulação do centrossomo e do ciclo celular, são necessários para esclarecer a função de Nek7 na carcinogênese, uma vez que as alterações causadas por Nek7 nesses eventos, estão diretamente ligadas a tumorigênese. Para tal, neste trabalho, serão realizados estudos funcionais envolvendo silenciamento por RNA (iRNA) da expressão de Nek7 e sua superexpressão em células humanas bem como a identificação de proteínas que interagem com Nek7 através ensaios de pull down e imunoprecipitação, seguido de espectrometria de massa na tentativa de elucidar a cascata de sinalização a qual a Nek7 está envolvida. Estudos prévios em nosso laboratório demostraram uma possível interação entre as proteínas Nek7 e Mat1, através de ensaios de duplo hidrido, sendo assim serão realizados ensaios na tentativa de confirmar e desvendar possíveis função de Nek7 em relação a sua interação com Mat1, o qual faz parte de uma tríade regulatória juntamente com CDK7 e Ciclina H, onde juntas desempenham funções na regulação da transição no ciclo celular: iniciação da síntese do DNA na fase S e entrada em mitose bem como eventos relacionados a tumorigênese. Também serão realizados estudos fisiológicos e tumorigênicos, visando a análise da expressão e atividade de CAK (CDK7/Ciclina H/MAT1) em células MEFs (Mouse Embryonic Fibroblast) derivadas de embrião de camundongos Nek7-/-, análise do crescimento ou inibição de tumores em animais tratados com células siRNA, quinase dead e Nek7 fosfomiméticas bem como análise da expressão e atividade de CAK (CDK7/Ciclina H/MAT1) em células originadas de animais submetidos aos diferentes tratamentos. Para finalizar serão realizados bioensaios in vitro com o uso da plataforma HTS (High Throughput Screening) recentemente instalada no LNBio, para screening e caracterização de inibidores de Nek7 que possam ser utilizados para testes de inibição de crescimento de tumores. (AU)