Caracterização funcional de camundongos e células nocaute para os genes que codificam as proteínas regulatórias Ki-1/57 e CGI-55

Resumo

Ki-1/57 foi descoberta através da reatividade cruzada com um anticorpo monoclonal Ki-1, o primeiro anticorpo descrito para detectar células de linfoma de Hodgkin. Estudos preliminares dessa proteína revelaram características muito comuns a onco-proteínas. Experimentos de duplo-híbrido em leveduras identificaram proteínas parceiras envolvidas no controle da transcrição e metabolismo de RNA. Muitas delas são proteínas que se ligam diretamente a p53 ou fazem parte da família p53, fator de transcrição supressor tumoral e um importante mediador de resposta ao estresse celular. Foi identificado também que Ki-1/57 interage com proteínas envolvidas em splicing, colocaliza com grânulos de estresse e é sumoilada. Dados de experimentos de microarray, publicados recentemente pelo nosso grupo, oferecem uma nova perspectiva da função de Ki-1/57, o seu envolvimento em mecanismos de resposta celular a estresse, uma vez que sua superexpressão levou a repressão de genes envolvidos na proliferação e morte celular. Em conjunto com as informações de interação proteína-proteína disponíveis, esses dados de microarray e localização subcelular, sugerem que a ação de Ki-1/57, sob essas condições, ocorreria nos diferentes níveis do controle da expressão gênica, desde transcrição à tradução. Com o intuito de avaliar com maior profundidade as possíveis funções de Ki-1/57 pretendemos realizar superexpressão de Ki-1/57 e p53, seguidos de estudos de ciclo celulares e estresse. Ki-1/57 também tem sido relacionada com câncer, tendo sido observada sua expressão em células tumorais. Pretendemos investigar melhor o papel de Ki-1/57 e CGI-55 na regulação da expressão gênica através da identificação do perfil dos RNAs mensageiros (mRNAs) alvos de Ki-1/57 e CGI-55 e mapear os seus sítios de ligação no RNA através de cross-linking immunoprecipitation seguido de sequenciamento de nova geração (CLIP-seq). Além disso, estamos em fases avançadas de geração de um camundongo nocaute para o gene Ki-1/57. Conseguimos gerar animais mosaicos nocautes para Ki-1/57 utilizando o novo sistema CRISPR/Cas9. Também já temos células-tronco embrionárias (ES) heterozigotas nocaute para Ki-1/57 que foram geradas pelo método clássico de recombinação homóloga em células-tronco embrionárias. Estamos investigando o papel de Ki-1/57 em células-tronco pluripotentes e na diferenciação neuronal e em cardiomiócitos. Em primeiras injeções das células ES nocaute de Ki-1/57 em blastocistos obtivemos animais quimeras. Grande parte do projeto trataria da caracterização histológica, morfológica, fisiológica e funcional de animais nocaute Ki-1/57 hetero e homozigotos comparado com animais selvagens. (AU)