Estudo epigenético das enzimas desmetilases de histona dependentes de Fe(II) e ±-cetoglutarato da família jumonji no contexto do metabolismo tumoral e atividade glutaminase

Resumo

Enzimas que adicionam ou removem os grupos metil-lisina em caudas de histonas são sensíveis a alterações no metabolismo celular pois utilizam co-substratos metabólicos. As desmetilases de histonas (HDMs) contendo o domínio JmjC (JHDMs) utilizam ±-cetoglutarato (±-CG) derivado da via glicolítica ou glutaminolítica numa reação de hidroxilação que remove grupos metil-lisina das caudas das histonas H3 e H4. A conversão de ±-CG a partir de glutamina é particularmente importante para certos tipos de células tumorais e confere o fluxo metabólico necessário para garantir o crescimento e a viabilidade destas células. Foi mostrado que a concentração intracelular de ±-CG varia entre células normais e tumorais o que pode estar associado a regulação da atividade das JHDMs, ao processo tumorigênico e à manutenção de células tumorais stem-like (CSCs). Tumores de câncer de mama do tipo triplo negativo (TNBC) com perfil de expressão mesenquimal stem-like (MSL) e claudin low apresentam atividade JHDMs desregulada, são mais agressivos, resistentes a terapia e menos diferenciados, fenótipo associado a manutenção de populações CSCs e ao mecanismo de transição epitélio-mesênquima. Além, esses tumores consomem mais glutamina e possuem expressão aumentada da glutaminase C (GAC). Dessa forma, o objetivo desse trabalho é estudar a importância da glutaminólise na produção do cofator ±-CG em modelo de câncer de mama (com foco em TNBC), assim como sua relação com a manutenção de populações CSCs, sua importância para EMT e para os comportamentos celulares associados a estes processos. Para isso, o knockdown contra o gene glutaminase 1 (GLS1) e/ou a isoforma GAC e a superexpressão de GAC wild-type e da forma mutada K320A (com atividade catalítica aumentada), serão realizados em três linhagens mamárias, MCF-10A, não tumoral, MCF-7, uma linhagem não TBNC luminal diferenciada e MDA-MB-231, uma linhagem TNBC com perfil de expressão MSL similar a tumores claudin low indiferenciados. A superexpressão e o knockdown serão confirmados por western-blot (WB) e o nível de ±-CG intracelular será dosado colorimetricamente. O estado de metilação global em histonas será acompanhado passagem por passagem por citometria de fluxo, enquanto que populações CSCs serão quantificadas por citometria de fluxo, empregando-se o sistema ALDEFLUOR. O perfil global de metilação em H3 e H4 também será determinado por espectrometria de massas LS-MS-MS e o status de metilação de promotorees de genes associadas a diferenciação celular, ao fenótipo stem-like e EMT, incluindo as vias TGF-², NOTCH, WNT e o cluster de genes HOX já descritos como regulados por JHDMs, será determinado usando kits de arrays comerciais de qPCR e ChIP-qPCR. A ocorrência de EMT será determinada por WB e imunofluorescência com anticorpos para as proteínas E-caderina, N-caderina, Vimentina e BMI-1. Por fim, se determinado que EMT e o aumento de populações CSCs são dependentes da disponibilidade de ±-CG produzido por glutaminólise, serão realizados ensaios funcionais de formação de esferas (ensaio funcional de células tronco in vitro), ensaios de migração celular empregando o método scratch e ensaio funcional de invasão em câmara de Boyden recoberta com Matrigel. A enzima glutaminase tem sido mostrada ser essencial para a proliferação celular mas ainda é desconhecida sua relação com o status epigenético celular. Este trabalho propõe desvendar esta relação, o que terá consequência direta no entendimento desta enzima como alvo no combate ao câncer. (AU)