Estudo funcional e molecular da cinase humana NEK6 como alvo de drogas contra Câncer de Próstata

Resumo

Membros da família de NEK cinases (NIMA related kinases) foram identificados como importantes reguladores de pontos de checagem do ciclo celular, especialmente na transição G2 para M. Apesar de ser uma das famílias de cinases menos estudadas, recentes estudos mostraram que elas podem ter papéis crucias na mitose, separação dos centrômeros e em vias de sinalização de danos de DNA. Essas características junto ao fato de que vários membros da família são super-expressos em Câncer ou apresentam elevadas taxas de mutação tornam elas interessantes candidatas alvos no diagnóstico e na terapia do Câncer. A super-expressão de NEK6 foi relatada em diversos tipos de Câncer, mas recentemente foi verificado seu papel central no desenvolvimento do Câncer de Próstata Resistente a Castração (CPRC). Estudos previamente publicados pelo grupo revelaram que NEK6 fosforila proteínas da via de sinalização de NF-κB (e.g. RelB, Prx-III e TRIP-4). Tal via é essencial para a sobrevivência celular e, interessantemente, também parece ter papel importante no CPRC. Objetivo: Para tanto o objetivo central deste projeto é descrever os mecanismos in vitro e in vivo pelos quais NEK6 contribui para o desenvolvimento de Câncer de Próstata e sua relação com a via de sinalização de NF-κB. Investigar se NEK6 possui envolvimento na resistência ao quimioterápico docetaxel. Por fim, identificar novos substratos fisiológicos e novos potenciais inibidores da NEK6 humana. Metodologia: Para os estudos in vitro, utilizaremos células de Câncer de Próstata metastático resistentes à castração (PC-3, DU-145 e 22Rv1), que terão o knockout do gene NEK6 pelo sistema CRISPR/Cas9, e assim, estudos funcionais (migração, proliferação, viabilidade, ciclo celular e apoptose) e moleculares (avaliação da via NF-κB) serão realizados. Para os estudos in vivo, a linhagem de células PC-3 com knockout de NEK6 serão injetadas de forma subcutânea em camundongos nude imunodeficientes, e serão analisadas alterações na progressão tumoral. Uma posterior análise proteômica dos tumores será realizada para verificar mudanças no perfil de expressão protéica. A partir da "abordagem de Shokat" será desenvolvida uma cinase NEK6 que reconhece análogos à ATP e, a partir disso, será identificado, por espectrometria de massas, novos substratos fisiológicos. Para estudar o envolvimento de NEK6 na resistência ao docetaxel, serão gerados modelos de células de Câncer de Próstata resistentes ao quimioterápico (PC-3r, DU-145r e 22Rv1r) através de protocolos já estabelecidos. Realizaremos triagens de compostos in vitro pelo método "Bioensaio High Throughput Screening", baseado na tecnologia de um ensaio acoplado que usa luciferase para detectar o consumo de ATP da cinase, desenvolvido previamente no grupo. Expectativas: O projeto contribuirá para entender os mecanismos pelo qual NEK6 é importante para o desenvolvimento de Câncer de Próstata e, com isso, será analisado o potencial dessa proteína cinase como alvo terapêutico, visando à obtenção de novos inibidores específicos. (AU)