Uso das técnicas de transcriptoma, exoma e expressão gênica para elucidar diferentes fenótipos de distúrbios da diferenciação do sexo em pacientes 46,xy

Resumo

As condições que apresentam desenvolvimento genital e/ou gonadal incompleto ou desordenado levando a uma discordância entre o sexo genético, gonadal e fenotípico do indivíduo afetado são classificadas como Distúrbios da Diferenciação do Sexo (DDS). São conhecidos diversos genes que atuam nas vias da determinação e diferenciação do sexo, como por exemplo: WT1, SRY, NR5A1, DMRT1, SOX9, GATA4, NR0B1, HAM, RA, SRD5A2, HSD17B3, entre outros. Entretanto, após a triagem em busca de mutações nesses genes, duas questões importantes se apresentam. A primeira delas diz respeito aos casos em que mutações são identificadas. Nesses casos o desafio principal é investigar o efeito biológico que estas exercem e quais seriam suas reais influências nos fenótipos. A segunda questão a ser enfrentada é que através do sequenciamento gene a gene, cerca de 60-70% dos casos permanecem com etiologia indefinida. Na tentativa de abordar essas duas questões frente aos resultados de estudos anteriores, propomos este projeto que será dividido em duas partes. A primeira será analisar a função gênica in vitro por expressão de gene repórter e in vivo através do transcriptoma de material de biópsia de pacientes que apresentam mutações em dois receptores nucleares (RA e NR5A1), a fim de averiguar como estas alterações afetam a regulação de genes, causando um possível desequilíbrio no padrão de expressão gênica, e correlacionar os efeitos observados com os diferentes fenótipos apresentados pelos pacientes. Para tal, serão realizados estudos in vitro de transfecção em células de mamíferos, além de RNA-seq e PCR Real Time, com RNA obtido a partir das gônadas ou tecido genital dos pacientes. A segunda parte, visa analisar por sequenciamento de exoma, 10 pacientes classificados como DDS 46,XY idiopáticos, com o intuito de identificar a presença de variantes patogênicas e, eventualmente, revelar novos genes envolvidos na diferenciação testicular. Dessa maneira, este trabalho poderá contribuir para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares que possam explicar o fenótipo dos pacientes, bem como, servirá para implementar os estudos de exomas e transcriptomas em nosso laboratório.