| Processo: | 11/14329-9 |
| Modalidade de apoio: | Auxílio à Pesquisa - Regular |
| Data de Início da vigência: | 01 de dezembro de 2011 |
| Data de Término da vigência: | 28 de fevereiro de 2014 |
| Área do conhecimento: | Ciências Biológicas - Morfologia - Citologia e Biologia Celular |
| Pesquisador responsável: | Luciana Amaral Haddad |
| Beneficiário: | Luciana Amaral Haddad |
| Instituição Sede: | Instituto de Biociências (IB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil |
| Pesquisadores associados: | Luis Eduardo Soares Netto ; Luiz Roberto Giorgetti de Britto ; Silvana Chiavegatto |
| Assunto(s): | Neurônios Proteína do X frágil de retardo mental Expressão gênica Isoformas de proteínas Processamento de RNA Éxons |
| Palavra(s)-Chave do Pesquisador: | isoformas proteicas | neurônio | proteína ligante de rna | síndrome do X frágil | splicing de rna | Expressão gênica e Neurociências |
Resumo
A Proteína do Retardo Mental do X Frágil (FMRP), produto da expressão do gene do Retardo Mental do X Frágil 1 (FMR1), tem habilidade para ligação a RNA e expressão significativa no cérebro, principalmente no córtex cerebral, hipocampo e cerebelo. Os transcritos do FMR1 sofrem splicing alternativo resultando em até 20 isoformas possíveis e não redundantes da FMRP. O segundo domínio KH (KH2) da FMRP foi implicado na ligação da proteína a ribossomos. Sua alça variável é a mais longa já identificada entre proteínas humanas com domínios KH. A expressão do éxon 12 do FMR1 pode ainda acrescentar 21 resíduos de aminoácidos, em fase, a esta alça. Demonstramos anteriormente que a expressão do éxon 12 em transcritos do Fmr1 de rato é regulada ao longo do desenvolvimento pós-natal precoce, de forma diferencialmente positiva no córtex cerebral frontal. Desenvolvemos um anticorpo (3460) que detecta o segmento codificado pelo éxon 12 em isoformas endógenas da FMRP (FMRP+12ISO). Análises com o 3460 indicaram que essas isoformas têm, no córtex cerebral frontal, um pico de expressão que precede a maturação sináptica. Desconhece-se, entretanto, a relevância funcional e o mecanismo dessa regulação nesse segmento do sistema nervoso central. Buscando entender como essa forma de splicing do Fmr1 é regulada positivamente, desenvolvemos um mini-gene com o segmento genômico parcial do Fmr1. Além disso, é possível que os complexos ribonucleoprotéicos, contendo as FMRP+12ISO, permitam novas interações com proteínas ou RNA através da longa alça variável do domínio KH-2 da FMRP, trazendo um ganho funcional à proteína. Neste projeto, pretendemos analisar (i) a composição dos complexos moleculares contendo as FMRP+12ISO, no córtex cerebral frontal, através de ensaios de co-imunoprecipitação e filtração em gel e identificação protéica por espectrometria de massas; (ii) a distribuição das FMRP+12ISO em fases mais precoces do desenvolvimento embrionário do cérebro de rato através de imunohistoquímca; e (iii) alguns aspectos fenotípicos da diferenciação neuronal in vitro em células de neuroesferas, cuja expressão do éxon 12 do Fmr1 foi inibida. É também nosso objetivo realizar um levantamento de proteínas ativadoras do splicing do éxon 12 do Fmr1, através de ensaios de precipitação por afinidade entre transcritos biotinilados e proteínas de extrato nuclear de córtex cerebral. Esses ensaios serão realizados com transcritos do clone do mini-gene tipo-selvagem ou do clone mutado em que houve deleção intrônica de um segmento contendo candidatos a acentuadores do splicing. As proteínas precipitadas serão avaliadas por espectrometria de massa e análise comparativa entre as duas condições. (AU)
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