| Processo: | 11/20569-2 |
| Modalidade de apoio: | Auxílio à Pesquisa - Regular |
| Data de Início da vigência: | 01 de fevereiro de 2012 |
| Data de Término da vigência: | 31 de janeiro de 2014 |
| Área do conhecimento: | Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas |
| Pesquisador responsável: | Arthur Henrique Cavalcante de Oliveira |
| Beneficiário: | Arthur Henrique Cavalcante de Oliveira |
| Instituição Sede: | Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil |
| Município da Instituição Sede: | Ribeirão Preto |
| Assunto(s): | Enzimas Núcleosídeo-difosfato quinase Leishmania major |
| Palavra(s)-Chave do Pesquisador: | biofísica de proteínas | bioquímica de proteínas | leishmania | mutação sitio dirigida | Parasitas | Estrutura e Função de Proteínas |
Resumo
A nucleosídeo difosfato kinase b (NDKb) é uma enzima responsável pela produção de nucleosídeos trifosfatados e está envolvida com vários processos celulares. A NDKb é secretada no meio extracelular e considerada um fator de patogenicidade em patógenos intracelulares como Mycobacterium tuberculosis, Vibrio cholerae e L. amazonensis. Este projeto tem por objetivo caracterizar a atividade cinética da enzima recombinante nucleosídeo difosfato kinase b (NDKb) de L. major e avaliar o efeito de mutações no sítio ativo e na interface oligomérica, relacionando as alterações na estrutura com a atividade catalítica e funcional da enzima. Mutações sítio-dirigidas foram realizadas e testes de expressão mostraram que os mutantes foram produzidos em E. coli e serão purificados e caracterizados nesse projeto. A caracterização cinética com doadores de fosfato está em andamento no laboratório e, nesse projeto, serão obtidos os parâmetros cinéticos com nucleotídeos doadores e aceptores de fosfato da proteína recombinante selvagem e dos mutantes, via análise cromatográfica, usando HPLC, dos produtos da reação. Estudos de estrutura em solução de dicroísmo circular, de fluorescência intrínseca do triptofano e de filtração em gel e SAXS serão realizados para a avaliação da estabilidade da estrutura secundária, terciária e quaternária da NDKb nativa e mutantes. A exposição de proteínas secretadas a vários ambientes, inclusive com alterações no pH, justificam os diferentes experimentos com variação de pH para analisar as mudanças estruturais e de atividade da NDK, durante o ciclo de vida do parasita. Com fluorescência, serão avaliadas a supressão e anisotropia de fluorescência intrínseca, que informam sobre o acesso de supressores e do movimento da estrutura, permitindo inferências sobre a estrutura nos diferentes ambientes de pH e agentes desnaturantes. Ainda, com dicroísmo circular, será obtido o perfil por desnaturação térmica, por agentes caotrópicos e por variação de pH, com o intuito de verificar alterações na estrutura secundária e terciária desses mutantes. A estrutura quaternária será analisada por filtração em gel e SAXS para analisar o efeito das mutações no perfil de oligomerização, analisado com agentes caotrópicos e com variação de pH. Os efeitos dessas mutações na LmNDKb serão correlacionados com uma abordagem funcional, com experimentos de citotoxicidade e invasão macrófagos na presença proteínas mutantes e, após a obtenção de parasitas superexpressando as NDKs mutantes, será analisada a virulência de patas de camundongo e a invasão de macrófagos. Assim, com esses resultados pretende-se correlacionar o papel de regiões da NDK na manutenção estrutura e atividade catalítica com as ações da NDKb na do parasita com o hospedeiro. (AU)
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