Análise do papel de NEK1 na regulação da resposta à danos de DNA nuclear e mitocondrial

• Processo: 17/21067-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 05 de fevereiro de 2018
• Data de Término da vigência: 04 de fevereiro de 2019
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Jörg Kobarg
• Beneficiário: Mariana Bonjiorno Martins
• Supervisor: David M. Wilson III
• Instituição Sede: Instituto de Biologia (IB). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: National Institutes of Health, Bethesda (NIH), Estados Unidos
• Vinculado à bolsa: 16/02040-8 - Analise funcional de mutações em nek1 e nek7 em câncer e identificação dos seus substratos fisiológicos, BP.PD
• Assunto(s): Células tumorais DNA mitocondrial Dano ao DNA Quinase 1 relacionada a NIMA
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Mitochondrial DNA Damage | Nek1 | Nuclear DNA Damage | Sinalização em Células de Câncer

Resumo

A proteína Nek1 pertence às quinases está relacionada à NIMA ou a família "Neks", que consiste em onze proteínas denominadas Nek1 a Nek 11, estão associados funcionalmente com mitose, regulação do cílio e a resposta ao dano do DNA. Os defeitos no reparo do DNA são sugeridos em células deficientes em Nek1 pela persistência de quebras de DNA de fita dupla após exposição a radiação ionizante ou luz ultravioleta. Usando o domínio regulatório e catalítico de Nek1 como isca, identificamos parceiros de proteína interativos que estão envolvidos na regulação do ciclo celular e no reparo de DSBs. Entre os identificados foram a exonuclease de DNA Mre11, o remodelador de cromatina ATRX e um parceiro de ligação do supressor de tumor P53, 53BP1. O envolvimento de Nek1 no reparo foi ainda demonstrado por aumento da atividade da quinase, evento que resultou na redistribuição e fosforilação de Nek1 do citoplasma para o núcleo, onde colocalizou com os e-H2AX e Nfbd1 / Mdc1in. Nossos estudos de interação também revelaram que os parceiros do Nek1 estão envolvidos em reparo de DNA dirigido por homologia, reparo de excisão de nucleotídeos (NER) e reparo de incompatibilidade (MMR). Além disso, nosso trabalho recente indica o envolvimento de Nek1 na resposta ao dano em relação ao agente cisplatina. Além disso, demonstrou-se que Nek1 participa de respostas de morte celular por fosforilação e alteração da conformação de VDAC1 que é responsável pela regulação do potencial de membrana mitocondrial. As células com deficiência ou silenciado para o Nek1 endógeno não conseguem fosforilar VDAC1 e consequentemente morrem precocemente após a exposição ao UV. Além disso, tais células mutantes têm um aumento na permeabilidade da membrana mitocondrial. Assim, no estado basal e em resposta a lesões, que inclui danos ao DNA, Nek1 fosforila VDAC1 para limitar a morte celular mitocondrial. O emprego de estudos funcionais é necessário para esclarecer o papel do Nek1 em resposta ao dano do DNA nuclear e mitocondrial (mtDNA), bem como sua participação nas vias de reparo do DNA. Para alcançar esse objetivo, usaremos um conjunto de linhas celulares disponíveis em nosso grupo: células HEK293T de tipo selvagem; Células HEK293T que superexpressam o tipo selvagem Nek1, e células HEK293T deficientes para Nek1 (shRNA). Essas células serão tratadas com uma gama de agentes genotóxicos na tentativa de avaliar Nek1 na resposta ao dano de DNA. Usaremos técnicas, como a medição do dano do DNA e do número de cópias de mtDNA, para avaliar os níveis de dano do DNA após a exposição de células mutantes Nek1 a diferentes agentes genotóxicos. A micro-irradiação a laser e microscopia confocal para introduzir danos de DNA localizados de diferentes tipos para visualizar o recrutamento/retenção de Nek1 e outras proteínas relacionadas ao dao. Também avaliaremos o efeito de silenciar Nek1 na progressão do ciclo celular após exposição a agentes genotóxicos usando métodos de citometria de fluxo. Os ensaios de imunodetecção serão realizados para avaliar a interação da Nek1 com proteínas relacionadas ao reparo e resposta do DNA. A funcionalidade mitocondrial será medida em células deficientes em Nek1 através de uma coleção de ensaios, como o dano de mtDNA, níveis de ROS, mitófagos e fosforilação oxidativa. Essas experiências conjuntamente elucidarão os mecanismos moleculares que envolvem Nek1 na regulação do ciclo celular, na resposta do dano e na atividade mitocondrial, potencialmente revelando uma correlação entre os compartimentos nuclear e mitocondrial. Dado que Nek1 é expressa em muitos tipos de cânceres humanos, nossos estudos irão contribuir para novas estratégias moleculares que possam ser buscadas no futuro como parte de um novo paradigma terapêutico. (AU)

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

MARTINS, MARIANA BONJIORNO; PEREZ, ARINA MARINA; BOHR, VILHELM A.; WILSON, III, DAVID M.; KOBARG, JORG. NEK1 deficiency affects mitochondrial functions and the transcriptome of key DNA repair pathways. MUTAGENESIS, v. 36, n. 3, p. 223-236, MAY 2021. (16/02040-8, 14/15982-6, 17/21067-7, 17/03489-1)

BETIM PAVAN, ISADORA CAROLINA; DE OLIVEIRA, ANDRESSA PERES; FIRMINO DIAS, PEDRO RAFAEL; BASEI, FERNANDA LUISA; ISSAYAMA, LUIDY KAZUO; FEREZIN, CAMILA DE CASTRO; SILVA, FERNANDO RIBACK; RODRIGUES DE OLIVEIRA, ANA LUISA; ALVES DOS REIS MOURA, LIVIA; MARTINS, MARIANA BONJIORNO; et al. On Broken Ne(c)ks and Broken DNA: The Role of Human NEKs in the DNA Damage Response. CELLS, v. 10, n. 3, MAR 2021. (16/02040-8, 17/21067-7, 17/03489-1)