Análise do papel de NEK1 na regulação da resposta à danos de DNA nuclear e mitocondrial

Resumo

A proteína Nek1 pertence às quinases está relacionada à NIMA ou a família "Neks", que consiste em onze proteínas denominadas Nek1 a Nek 11, estão associados funcionalmente com mitose, regulação do cílio e a resposta ao dano do DNA. Os defeitos no reparo do DNA são sugeridos em células deficientes em Nek1 pela persistência de quebras de DNA de fita dupla após exposição a radiação ionizante ou luz ultravioleta. Usando o domínio regulatório e catalítico de Nek1 como isca, identificamos parceiros de proteína interativos que estão envolvidos na regulação do ciclo celular e no reparo de DSBs. Entre os identificados foram a exonuclease de DNA Mre11, o remodelador de cromatina ATRX e um parceiro de ligação do supressor de tumor P53, 53BP1. O envolvimento de Nek1 no reparo foi ainda demonstrado por aumento da atividade da quinase, evento que resultou na redistribuição e fosforilação de Nek1 do citoplasma para o núcleo, onde colocalizou com os e-H2AX e Nfbd1 / Mdc1in. Nossos estudos de interação também revelaram que os parceiros do Nek1 estão envolvidos em reparo de DNA dirigido por homologia, reparo de excisão de nucleotídeos (NER) e reparo de incompatibilidade (MMR). Além disso, nosso trabalho recente indica o envolvimento de Nek1 na resposta ao dano em relação ao agente cisplatina. Além disso, demonstrou-se que Nek1 participa de respostas de morte celular por fosforilação e alteração da conformação de VDAC1 que é responsável pela regulação do potencial de membrana mitocondrial. As células com deficiência ou silenciado para o Nek1 endógeno não conseguem fosforilar VDAC1 e consequentemente morrem precocemente após a exposição ao UV. Além disso, tais células mutantes têm um aumento na permeabilidade da membrana mitocondrial. Assim, no estado basal e em resposta a lesões, que inclui danos ao DNA, Nek1 fosforila VDAC1 para limitar a morte celular mitocondrial. O emprego de estudos funcionais é necessário para esclarecer o papel do Nek1 em resposta ao dano do DNA nuclear e mitocondrial (mtDNA), bem como sua participação nas vias de reparo do DNA. Para alcançar esse objetivo, usaremos um conjunto de linhas celulares disponíveis em nosso grupo: células HEK293T de tipo selvagem; Células HEK293T que superexpressam o tipo selvagem Nek1, e células HEK293T deficientes para Nek1 (shRNA). Essas células serão tratadas com uma gama de agentes genotóxicos na tentativa de avaliar Nek1 na resposta ao dano de DNA. Usaremos técnicas, como a medição do dano do DNA e do número de cópias de mtDNA, para avaliar os níveis de dano do DNA após a exposição de células mutantes Nek1 a diferentes agentes genotóxicos. A micro-irradiação a laser e microscopia confocal para introduzir danos de DNA localizados de diferentes tipos para visualizar o recrutamento/retenção de Nek1 e outras proteínas relacionadas ao dao. Também avaliaremos o efeito de silenciar Nek1 na progressão do ciclo celular após exposição a agentes genotóxicos usando métodos de citometria de fluxo. Os ensaios de imunodetecção serão realizados para avaliar a interação da Nek1 com proteínas relacionadas ao reparo e resposta do DNA. A funcionalidade mitocondrial será medida em células deficientes em Nek1 através de uma coleção de ensaios, como o dano de mtDNA, níveis de ROS, mitófagos e fosforilação oxidativa. Essas experiências conjuntamente elucidarão os mecanismos moleculares que envolvem Nek1 na regulação do ciclo celular, na resposta do dano e na atividade mitocondrial, potencialmente revelando uma correlação entre os compartimentos nuclear e mitocondrial. Dado que Nek1 é expressa em muitos tipos de cânceres humanos, nossos estudos irão contribuir para novas estratégias moleculares que possam ser buscadas no futuro como parte de um novo paradigma terapêutico. (AU)