Construção de linhagens transgênicas modificadas por CRISPR/Cas9 para identificação de eventos de aneuploidia em Trypanosoma cruzi

• Processo: 19/05049-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de maio de 2019
• Data de Término da vigência: 31 de março de 2023
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
• Pesquisador responsável: José Franco da Silveira Filho
• Beneficiário: Thaise Lara Teixeira
• Instituição Sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 16/15000-4 - Trypanosoma cruzi: variabilidade genômica intra- e interespecífica e mecanismos de invasão/evasão celular, AP.TEM
• Assunto(s): Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas Peixes Aneuploidia Trypanosoma cruzi Variação genética Proteína 9 associada à CRISPR
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: aneuploidia | Cas9 | Crispr | Fish | Trypanosoma cruzi | Variabilidade Genética | Biologia Molecular de Parasitos

Resumo

Análise genômica indica que T. cruzi é diploide para a maioria de seus cromossomos. Porém, eventos de aneuploidia foram detectados em alguns cromossomos por aCGH e NGS (next generation sequencing). Tem sido sugerido que aneuploidia pode ser um importante fator na geração de diversidade genética em T. cruzi, um organismo no qual a reprodução sexuada está ausente ou é muito rara. Pela comparação entre cepas e clones de T. cruzi por aCGH identificamos eventos de deleção ou duplicação em pequenos segmentos cromossômicos (aneuploidia segmentar). Também identificamos alterações em toda a extensão do cromossomo, com duplicação ou perda de um cromossomo completo. Em Leishmania, existe em uma mesma população celular, subpopulações com diferentes graus de ploidia para um ou mais cromossomos, resultando em uma estrutura conhecida como "aneuplodia em mosaico". A variação de ploidia tem sido relacionada com a resistência aos quimioterápicos em isolados clínicos de L. donovani.A aneuploidia é um fenômeno emergente em T. cruzi com várias questões em aberto, como por exemplo: Quais os mecanismos responsáveis pela aneuploidia em T. cruzi? Existe aneuploidia em mosaico e qual seria o papel deste fenômeno neste parasita? Pretendemos investigar a presença de aneupoidia em cepas de T. cruzi assim como em clones derivados de uma mesma cepa parental. A técnica de FISH é a mais apropriada porque permite estimar o número de células aneuplóides na população e identificar os cromossomos envolvidos no processo. Contudo face ao pequeno tamanho do núcleo e dos cromossomos de T. cruzi, a técnica de FISH tem que ser aprimorada para detecção de sequências cópias únicas. Neste projeto propomos uma nova estratégia para identificar sequências alvos específicas do cromossomo TcChr24 da cepa CL e do clone CL Brener (CLB) de T. cruzi por meio da inserção de tags utilizando CRISPR/Cas9. Para alcançar este objetivo estão previstas as seguintes etapas: 1) Identificar sequências cromossomo-específicas (sequências alvo para FISH) no cromossomo TcChr24 (aneuplóide) de T. cruzi;2) Gerar linhagens transgênicas da cepa CL e clone CLB com editoração do cromossomo TcChr24, substituindo-se pela técnica de CRISP/Cas9 as sequências alvo para FISH pelo gene blasticidina em fusão com repetições exógenas sem similaridade no genoma de T. cruzi; 3) Analisar eventos de aneuploidia ao longo das gerações na cepa CL e do clone CLB.

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

TEIXEIRA, THAISE LARA; CHIURILLO, MIGUEL ANGEL; LANDER, NOELIA; RODRIGUES, CASSIANO COSTA; ONOFRE, THIAGO SOUZA; FERREIRA, EDEN RAMALHO; YONAMINE, CAMILA MIYAGUI; SANTOS, JULIA DE GOUVEIA; MORTARA, RENATO ARRUDA; DA SILVA, CLAUDIO VIEIRA; et al. Ablation of the P21 Gene of Trypanosoma cruzi Provides Evidence of P21 as a Mediator in the Control of Epimastigote and Intracellular Amastigote Replication. FRONTIERS IN CELLULAR AND INFECTION MICROBIOLOGY, v. 12, p. 11-pg., 2022-02-18. (19/05049-4, 16/15000-4)