Construção de linhagens transgênicas modificadas por CRISPR/Cas9 para identificação de eventos de aneuploidia em Trypanosoma cruzi

Resumo

Análise genômica indica que T. cruzi é diploide para a maioria de seus cromossomos. Porém, eventos de aneuploidia foram detectados em alguns cromossomos por aCGH e NGS (next generation sequencing). Tem sido sugerido que aneuploidia pode ser um importante fator na geração de diversidade genética em T. cruzi, um organismo no qual a reprodução sexuada está ausente ou é muito rara. Pela comparação entre cepas e clones de T. cruzi por aCGH identificamos eventos de deleção ou duplicação em pequenos segmentos cromossômicos (aneuploidia segmentar). Também identificamos alterações em toda a extensão do cromossomo, com duplicação ou perda de um cromossomo completo. Em Leishmania, existe em uma mesma população celular, subpopulações com diferentes graus de ploidia para um ou mais cromossomos, resultando em uma estrutura conhecida como "aneuplodia em mosaico". A variação de ploidia tem sido relacionada com a resistência aos quimioterápicos em isolados clínicos de L. donovani.A aneuploidia é um fenômeno emergente em T. cruzi com várias questões em aberto, como por exemplo: Quais os mecanismos responsáveis pela aneuploidia em T. cruzi? Existe aneuploidia em mosaico e qual seria o papel deste fenômeno neste parasita? Pretendemos investigar a presença de aneupoidia em cepas de T. cruzi assim como em clones derivados de uma mesma cepa parental. A técnica de FISH é a mais apropriada porque permite estimar o número de células aneuplóides na população e identificar os cromossomos envolvidos no processo. Contudo face ao pequeno tamanho do núcleo e dos cromossomos de T. cruzi, a técnica de FISH tem que ser aprimorada para detecção de sequências cópias únicas. Neste projeto propomos uma nova estratégia para identificar sequências alvos específicas do cromossomo TcChr24 da cepa CL e do clone CL Brener (CLB) de T. cruzi por meio da inserção de tags utilizando CRISPR/Cas9. Para alcançar este objetivo estão previstas as seguintes etapas: 1) Identificar sequências cromossomo-específicas (sequências alvo para FISH) no cromossomo TcChr24 (aneuplóide) de T. cruzi;2) Gerar linhagens transgênicas da cepa CL e clone CLB com editoração do cromossomo TcChr24, substituindo-se pela técnica de CRISP/Cas9 as sequências alvo para FISH pelo gene blasticidina em fusão com repetições exógenas sem similaridade no genoma de T. cruzi; 3) Analisar eventos de aneuploidia ao longo das gerações na cepa CL e do clone CLB.