Padronização de BONCAT acoplado a PLA em células endoteliais primárias.

• Processo: 24/20224-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de dezembro de 2024
• Data de Término da vigência: 31 de julho de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Celular
• Pesquisador responsável: Thaís Larissa Araujo de Oliveira Silva
• Beneficiário: Andrea Katherine Pinto Martinez
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 18/13739-8 - Proteostase mediada pela chaperona molecular HSP70 em células endoteliais em resposta à força hemodinâmica, AP.JP
• Assunto(s): Proteínas de choque térmico HSP70 Bioquímica
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Boncat | clientes | Hsp70 | Bioquímica

Resumo

O grupo observou que o shear stress (SS) patológico reduz a expressão da HSP70 na célula endotelial (EC) da veia umbilical humana (HUVEC), aorta, na EC da artéria pulmonar (HPAEC) de pacientes com hipertensão pulmonar tromboembólicacrônica (CTEPH) e in vivo. Além disso, mostramos que a HSP70 é essencial para migração e angiogênese das ECs de diferentes berços vasculares. No entanto, no contexto de SS a redução dos níveis proteico da HSP70 é responsável pelo fenótipo da EC observado no SS patológico não é definida, além dos seus clientes específicos neste contexto. Os objetivos do presente TT5 são: (1) padronização da técnica de marcaçãocom aminoácido biortogonal (BONCAT/ bioorthogonal non-canonical amino-acid tagging) no SS, (2) padronização da imunoprecipitação (IP) da HSP70 endógena e avaliação do perfil proteico das protéinas clientes recém sintetizadas associadas -marcadas com homoziadoalanina (AHA) da técnica de BONCAT - sendo revelado o perfil de peso molecular das proteínas marcadas e (3) do acoplamento de BONCAT com ensaio de ligação por proximidade (PLA) que permitirá validar a interação da HSP70 com este pool de proteína recém sintetizado por confocal. Durante o JP foi descoberto que a perda de função da HSP70 inibe o alinhamento das EC no sentido fluxo, indicando papel da HSP70 na mecanotransdução das ECs. No entanto, é necessário ter os métodos acimas estabelecidos para avançarmos na identificação de quais proteínas clientes da HSP70 são afetados. Além de utilizar inibição farmacológica da HSP70 na busca dos clientes.