Expressão em E. coli e purificação de mutantes de bothropstoxina-I do veneno de B. jararacussu e mapeamento de superfície através de mutagênese sítio dirigida de triptofanos

• Processo: 01/06388-3
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2001
• Data de Término da vigência: 31 de dezembro de 2002
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica
• Pesquisador responsável: Richard John Ward
• Beneficiário: Tatiana Lopes Ferreira
• Instituição Sede: Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 96/11165-3 - Investigação da relação entre estrutura e função em fosfolipase lisina 49, AP.JP
• Assunto(s): Fosfolipases A2 Mutagênese sítio-dirigida
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Espectrofluorescencia | Fosfolipases A2 | Mutagenese Sitio Dirigida

Resumo

A bothropstoxina I (BthTX-I) é uma PLA2-Lis49 isolada do veneno de Bothrops jararacussu que apresenta uma substituição do aminoácido ácido aspártico por lisina na posição 49 do sítio ativo. Esta substituição impede a ligação do cofator Ca2+, com a conseqüente perda do ciclo catalítico produtivo. Embora sem atividade catalítica fosfolipásica, a interação da PLA2-Lis49 com lipossomos de composição lipídica provoca uma liberação rápida do conteúdo aquoso dos lipossomos por um mecanismo independente do Ca2+ que ainda é pouco conhecido. Utilizando a BthTX-I como um sistema modelo, pretende-se investigar as bases estruturais do mecanismo de danificação à membrana pelas PLA2-Lis49. O cDNA da BthTX-l foi isolado e sequenciado (Ward et al, 1995) e recentemente a proteína foi expressa em E. coli e purificada (Ward et al, 2001). Utilizando-se a técnica de mutagênese sitio-dirigida pretende-se produzir uma série de proteínas recombinantes com triptofanos únicos em diferentes regiões da molécula. À fluorescência intrínseca dos triptofanos será utilizada para avaliar o modelo proposto através do estudo das mudanças conformacionais da proteína em solução bem como quando em associação com membranas artificiais. (AU)

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

RULLER‚ R.; ARAGAO‚ EA; CHIOATO‚ L.; FERREIRA‚ T.L.; DE OLIVEIRA‚ AHC; SA‚ JM; WARD‚ RJ. A predominant role for hydrogen bonding in the stability of the homodimer of bothropstoxin-I‚ A lysine 49-phospholipase A₂. Biochimie, v. 87, n. 11, p. 993-1003, 2005. (96/11165-3, 00/11165-0, 98/14686-0, 01/06388-3, 98/14569-3)

SÁ‚ J.M.; CHIOATO‚ L.; FERREIRA‚ T.L.; DE OLIVEIRA‚ A.H.C.; RULLER‚ R.; ROSA‚ J.C.; GREENE‚ L.J.; WARD‚ R.J.. Topology of the substrate-binding site of a Lys49-phospholipase A2 influences Ca2+-independent membrane-damaging activity. Biochemical Journal, v. 382, n. Pt 1, p. 191, 2004. (96/11165-3, 00/11165-0, 98/14686-0, 01/06388-3, 98/14569-3)